① 颈椎脱臼法处死小鼠(图A);在解剖台上固定小鼠,从底端四肢剪开皮肤,小心剪开小鼠整个腹部皮肤,暴露出小鼠腹膜(图B);
② 小鼠淋巴结主要分布在:腹股沟左右两侧(图C)、腋窝(上箭头)和肱(下箭头)淋巴结的位置(图D);下颌骨(上方箭头)、腋窝(中间箭头)和臂部(底部箭头)淋巴结的位置(图E);左侧淋巴结位置在图示箭头处(图F),摘取下来淋巴结如图G所示;
③ 将取下的淋巴结置于预冷的PBS中浸泡待用;
将淋巴结置于在70μm筛网上,使用研磨棒轻柔碾碎,淋巴结细胞通过筛网过滤至PBS中;淋巴结充分研磨之后,收集筛网下端溶液至50mL 离心管中,在4℃条件下,300g离心5min,去除上清液;
通过70μm过滤网过滤,将过滤后的细胞悬液收集至离心管中,在4℃条件下,300g离心5min,去除上清液;
使用染色缓冲液重悬细胞调整细胞浓度至1*107/mL,吸取100μL细胞悬液至流式管中,准备染色。
1.研磨力度尽量轻柔,避免造成过多机械性死亡的细胞;
2.摘取淋巴结后,尽可能移除黏连的脂肪组织,提高淋巴结细胞的占比。
小鼠淋巴结中Tfh细胞检测分析
①通过FSC-A/SSC-A圈出淋巴细胞主群(图A.R1);
②用FCS-A/FCS-H去除粘连体信号,分析单细胞(图A.R2)
③圈出活性的T细胞:LD/B220-CD3+(图A.R3 ),在T细胞中圈出CD3+CD4+的细胞群(图A.R4);
④通过共表达高水平的CXCR5和PD1来鉴定Tfh细胞(图B);
⑤Tfh细胞高表达CD44和CXCR5(图C.左),并且转录因子Bcl6高表达(图C.右)。
① 颈椎脱臼法处死小鼠,在解剖台上固定小鼠(图A);小心剪开小鼠整个腹部皮肤,暴露出小鼠腹膜(图B);
② 切除腹壁;小心地切开隔膜(如箭头所示),而不损伤血管、肝脏或胆囊(图C);
③ 在不损害血管、肝脏、肺或心脏的情况下切除胸腔,暴露胸腺;胸腺用箭头标记(图D);
④ 将胸腺置于预冷的PBS中浸泡待用;
将胸腺置于在70μm筛网上,使用研磨棒轻柔碾碎,胸腺细胞通过筛网过滤至PBS中;胸腺充分研磨之后,收集筛网下端溶液至50mL 离心管中,在4℃条件下,300g离心5min,去除上清液;
通过70μm过滤网过滤,将过滤后的细胞悬液收集至离心管中,在4℃条件下,300g离心5min,去除上清液;
使用染色缓冲液重悬细胞调整细胞浓度至1*107/mL,吸取100μL细胞悬液至流式管中,准备染色。
1.研磨力度尽量轻柔,避免造成过多机械性死亡的细胞;
2.摘取胸腺后,尽可能移除黏连的脂肪组织,提高胸腺细胞的占比;
3.摘取过程中,避免手术器械破坏胸腺附近的血管;若胸腺上有大量血液残留,可用PBS冲洗1-2次后再进行单细胞悬液制备。
小鼠胸腺中Treg细胞检测分析
①通过FSC/SSC特性圈出淋巴细胞(G0)(图A);
②在淋巴细胞群(G0)中,通过FSC-A/FSC-H(图B)和SSC-A/SSC-W(图C)排除粘连体;使用死活染料圈出活细胞群体(G3)(图D);
③在活细胞中,圈出CD4+CD8-细胞群(图E.G4);随后展示FOXP3和CD25表达情况,区分两群Treg前体细胞(图F.G5&G6)和Treg细胞(图F.G7);
④胸腺Treg细胞可分为CD24highCD69+的未成熟细胞(图G.G9);和CD24dim/lowCD69-的成熟细胞(图G.G8);
⑤CD4SP细胞也可分为CD24highCD69+的未成熟细胞(图H.G10)和CD24dim/lowCD69-的成熟细胞(图H.G11)。
我的老板居然这样... ...
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