流式细胞术做为一种快速的细胞定量分析技术,能够同时对单个细胞进行多种特征参数的检测,如细胞大小、DNA含量、蛋白质表达等,现已成为科研领域中不可或缺的重要工具。
而流式检测能顺利进行的硬要求之一是,样本必须能在鞘液中流动,因此,无论是培养的细胞,还是从各种组织中提取出来的细胞,都需要把待测样本制备成单细胞悬液!制备欠妥的样本,不仅会直接影响实验的准确性和结果的可靠性,一些大的细胞团块甚至会堵塞液流系统而影响仪器的正常运行。
层浪技术宝典第二期,为更好地掌握流式检测的样本制备环节,给大家带来了小鼠淋巴组织单细胞悬液制备的全流程。希望你不管是实验“小白”还是有经验的研究者,都可以能从中受益,轻松搞定实验!
①颈椎脱臼法处死小鼠(图A);在解剖台上固定小鼠,从底端小心剪开小鼠整个腹部皮肤,暴露出小鼠腹膜(图B);
②剪开小鼠腹膜,暴露出脾脏,摘取,并充分去除上面的脂肪组织(图C、图D);
③将取下的脾脏置于预冷的PBS中浸泡待用。
将脾脏置于在70μm筛网上,使用研磨棒轻柔碾碎脾脏组织,脾脏细胞和红细胞通过筛网过滤至PBS中;脾脏充分研磨之后,收集筛网下端溶液至50mL离心管中,在4℃条件下,300g离心5min,去除上清液;
①在离心后的细胞悬液中加入1mL ACK红细胞裂解液,重悬细胞,在室温裂解5min;
②裂解结束后,加入5mL 含2% FCS的RPMI培养基终止裂解,涡旋混匀;
通过70μm过滤网过滤,将过滤后的细胞悬液收集至离心管中,在4℃条件下,300g离心5min,去除上清液;
使用染色缓冲液重悬细胞调整细胞浓度至1*107/mL,吸取100μL细胞悬液至流式管中,准备染色。
2.摘取脾脏后,尽可能移除黏连的脂肪组织,提高脾脏细胞的占比;
3.建议使用新鲜配制的红细胞裂解液。
小鼠脾脏中Th17细胞检测分析
① 通过FSC-H/SSC-H圈出淋巴细胞主群(图A);
② 通过CD3圈出总的T细胞:CD3+(图B);
③ 通过CD4/CD8圈出杀伤性T细胞(TCL):CD3+CD4-CD8+;辅助性T细胞(Th):CD3+CD4+CD8-(图C);
④ 在Th细胞群中,进一步圈出Th17细胞:CD3+CD4+CD8-IL-17A+(图D)。
我的老板居然这样... ...
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