新品应用 | 新型3D多孔可降解微载体在【疫苗领域】的应用

传统培养工艺下，贴壁细胞通常使用细胞培养瓶、滚瓶、或细胞工厂等进行培养，培养规模相对有限，培养过程难以控制，且难以在保障质量可控的前提下进行工艺放大。使用微载体结合生物反应器进行贴壁细胞的悬浮式培养，是一种非常好的解决方案。

传统微载体多采用合成聚合物制备的刚性实心微球，贴壁细胞在微载体表面呈2D曲面生长。在高投料密度下，反应器搅拌容易造成细胞死亡、并产生微载体碎片，对病毒产量及后续纯化造成成本增加、安全风险、回收率低等不可忽略的影响。[1]

华龛生物面向病毒类生物制品行业推出首款3D多孔可降解微载体——3D TableTrix® 微载体V01，不仅可用于贴壁细胞的育种与收获传代，还可用于病毒生产。

3D TableTrix® 微载体V01

与传统微载体相比，在细胞扩增、产毒方面优势明显。用于Vero细胞大规模培养，细胞密度均可达到1× 107cells/mL以上，细胞在生物反应器中可稳定逐级放大，最终实现分泌型病毒和胞内病毒高滴度生产。

图1：3D FloTrix® 细胞大规模培养技术用于病毒生产

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产品特点

Product Features

1. 呈蜂巢状多孔结构, 孔径范围30~50μm，孔隙率＞90%；

2. 比表面积高达9000cm2/g以上，约等同于传统微载体表面积2~3倍，可在同等投料密度下提供更多有效生长空间，承载更多贴壁细胞；

3. 微载体可完全降解，可提供由中检院核验的微载体降解残留检测方法（试剂盒）。实现无损收获细胞，可代替细胞工厂用于细胞育种和建立种子库；

4. 具有仿生的生物力学特性，可有效缓冲搅拌式反应器中的流体剪切力与微载体间的碰撞作用，更充分地保障细胞活率，从而提高病毒产量；

5. 放大工艺简单，细胞可实现罐转罐放大，全封闭工艺有效避免染菌风险；

6. 支持湿热在线灭菌，可用于不锈钢反应器的大规模生产使用。

Part.1微载体用于Vero细胞大规模培养工艺的建立

细胞育种：

使用10层工厂进行细胞育种，培养72h后用于反应器接种。

培养液

接种培养基为含10%NBS的SFM培养基，换液培养基为含1%NBS的SFM培养基。

微载体

3D TableTrix® 微载体V01,密度：2g/L。

细胞密度

微载体2g/L条件下，推荐细胞接种密度为25万-40万/mL。

接种条件

40rpm 5min，0rpm 25min循环8-16h后，调节为恒速45rpm。

细胞培养

细胞培养过程中每天取样计数并检测葡萄糖含量，葡萄糖含量低于1g/L时使用换液培养基进行换液，换液体积为总培养体积的80%。

放大比例

1 ：5

原位传代

细胞增殖4-5天，增殖倍数达8-10倍时，可以进行原位传代。

传代前先对微载体进行计数，计数方法为胰酶降解载体计数。

计数后沉降微载体，PBS清洗3次，用细胞消化酶消化约30min，细胞从微载体脱落，使用完全培养基终止消化。

根据下一级接种所需细胞将合适体积的细胞载体悬液转移至下一级反应器。

三级增殖效果

Vero细胞可实现三级放大，且细胞增殖稳定。

•细胞生长8天最高可实现1.37×108cells/mL密度（图2）。

图2.Vero大规模扩增细胞增殖曲线

•第一次转罐回收率93.8%；

• 第二次转罐回收率100%，且细胞维持较高活性（图3）。

图3.Vero大规模扩增细胞增殖和消化荧光图

Part.2微载体用于Vero细胞大规模培养工艺的优化

为了进一步降低经济成本和操作复杂性，在原接种工艺上对接种培养基及换液培养基进行优化，将接种培养液血清浓度降低至3%，换液培养基不使用血清，并进一步放大培养比例至1:8。

由于换液时不使用血清，传代消化时也可将清洗次数由3次降低到1次，有效的节省试剂耗材成本和操作时间。

工艺优化后扩增结果：不添加血清不影响细胞的增殖效率，细胞生长5天可实现5.42×106cells/mL密度（图4）。传代时PBS清洗一次不影响消化效率转罐回收率为93.3%，且细胞维持较高活性。

图4.工艺优化后细胞增殖曲线

Part.3微载体用于猪流行性腹泻病毒（PEDV）生产

使用3D TableTrix® 微载体V01培养Vero细胞72h（Day 3）后，密度增殖到2.5×106cells/mL左右接种PEDV, 接种后每天收取上清检测滴度，获得病毒滴度峰值，并做二维产毒对比。

用于生产PEDV结果：病毒接种后微载体上的细胞逐渐病变脱落，接毒后160h微载体上的细胞几乎完全脱落（图5）。

图5. 接种PEDV前后细胞状态

病毒滴度最高可达108.57 TCID50/mL，比二维平面工艺最高提高100倍以上（图6）。

图6. 两种培养方式PEDV滴度对比

Part.3微载体用于Vero细胞大规模培养工艺的优势

1.细胞增殖迅速，5天可以实现10倍增殖。

2.90%以上的细胞回收率保证较高的放大比例。

3.转罐操作简便，1-2人即可操作，节省人力成本。

4.血清用量少，有效降低成本。

5.用于病毒生产可以显著提高病毒滴度，进而提高病毒生产效率。

基于华龛微载体的Vero细胞大规模培养工艺，在微载体密度2g/L，细胞接种密度30万/ml条件下，采用无血清培养基培养5天细胞即可增殖10倍，通过罐内消化的方式传代，细胞回收率均在90%以上。

在通过此工艺培养Vero细胞用于猪流行性腹泻病毒生产时病毒滴度显著优于二维平面培养的细胞。本工艺载体用量少，操作简单，同时可降解载体收获细胞，满足不同疫苗生产工艺需求。

总结

3D TableTrix® 微载体V01在Vero细胞的培养中表现出了较好的优势，相对于现有的的培养方式，使用相对低密度的V01微载体即可实现细胞的大规模扩增，且微载体可降解，实现细胞的无损收获，工艺简单，易于放大。

凭借3D TableTrix® 微载体V01配合3D FloTrix® 自动化生物反应器的独特优势，在满足疫苗产业对于细胞数量和质量需求的同时，大大降低人工、时间及仪器耗材等成本。这为疫苗企业提供了新选择，带来了新动力。

产品资质

Product Qualification

华龛生物的核心产品3D TableTrix® 微载体，源于清华大学科技成果转化，可作为细胞生长的微环境(Microniche) 实现细胞体外高质量扩增。

该产品已获得：

• 2项国家药监局药用辅料资质：CDE审批登记号为【F20200000496、F20210000003】；

• 1项美国FDA-DMF药用辅料资质：备案号为【DMF-35481】。

药用辅料资质

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参考文献

[1] Kurokawa M, Sato S. Growth and poliovirus production of Vero cells on a novel microcarrier with artificial cell adhesive protein under serum-free conditions. J Biosci Bioeng. 2011 May;111(5):600-4. doi: 10.1016/j.jbiosc.2010.12.018. Epub 2011 Jan 23. PMID: 21262586.