适合的才是最好的︱微载体细胞培养技术【接种】工艺最佳条件

Introduction

微载体是直径50到300μm，密度略大于水，表面可供贴壁细胞贴附生长的微珠材料。与传统二维基质材料相比具有更高比表面积，在同等规模的培养容器内可培养更多数量的细胞，并且可搭配生物反应器实现细胞大规模悬浮培养，有效节约人力、物力、空间成本。

微载体细胞培养技术流程包括：细胞接种、细胞增殖和细胞收获三个主要阶段。其中，细胞接种是将种子细胞加入含有微载体的培养容器，使细胞贴附到微载体表面的过程。选择适宜的接种工艺条件，使细胞能够高效、均匀地贴附微载体（图1），从而充分利用微载体的比表面积，成为保证后期细胞大规模扩增的重要前提。

图1：细胞贴附在3D微载体表面

（图源：华龛生物，侵权必究）

一般而言，用于接种微载体的种子细胞应尽量选用处于指数生长期、而非平台期的细胞。据文献报道，接种处于指数增长期、而非长至汇合的细胞，微载体培养细胞产量可能提高2-3倍^[1]。

同时，为保证贴附均匀度，应采用单细胞悬液、而非细胞团块接种微载体。如采用二维贴壁培养方式育种，应保证贴壁的细胞经过蛋白酶（如胰蛋白酶）充分消化为圆形单悬细胞，而非仅限于将细胞从培养表面脱附。否则，脱附但未经充分消化的细胞可能仍保持细胞-细胞间贴附，自发结团，无法均匀贴附微载体。

需要注意的是，蛋白酶消化时间过长可能会对细胞活力造成损伤，甚至诱导细胞(如一些种类的干细胞)凋亡，因此需要针对不同细胞特点选择适宜的消化酶和消化时长，以尽量保持细胞活性^[2]。

微载体培养细胞的产量上限与细胞生长总面积、也即微载体总表面积直接相关，同时也受到培养基用量的制约。因此，微载体浓度和细胞密度并非越高越好，而是应选择最大化利用培养基营养，同时保证体系内溶氧、pH等环境参数稳定的浓度或密度。

市场上多数厂商推荐的微载体浓度为每升培养基1至6克微载体。而接种细胞密度除了受到培养基用量和微载体浓度影响外，还受细胞本身贴附速率、生长特性影响，一般建议每毫升接种10⁴-10⁶个细胞。

在接种初期，细胞-微载体的个数比例会直接影响细胞的贴附效率和均匀度。

◆ 过低的细胞-微载体比例会导致部分微载体无法被细胞贴附，降低微载体表面利用率和后续细胞增殖倍数。据理论估算，如果细胞-微载体比例低至1:1，体系内最终将有36.5%的微载体没有细胞贴附；而若将细胞-微载体比例提升至4:1，这一比例会下降到1.8%^[3]。

◆ 由于微载体表面积有上限，接种的细胞-微载体比例也不必过高，以免浪费细胞。经验显示，不同种类细胞、或同种细胞在不同类型微载体表面的最适接种比例均有差异^[2]。例如，猴肾VERO细胞接种实心球型微载体的最适细胞-微载体比例不低于8:1^[4]，接种多孔微载体的最适比例则为30:1至60:1^[5]。

目前，大部分微载体厂商都会提供微载体产品的单位质量颗粒数信息，用户可根据微载体用量计算适宜的接种密度。

桨叶搅拌式生物反应器是最常与微载体联用的细胞培养平台。在接种阶段，应适当搅拌培养体系，使细胞与微载体充分接触，帮助细胞高效、均匀地贴附微载体。接种阶段的搅拌模式可分为持续搅拌和间歇搅拌。

◆ 间歇搅拌模式是指间歇性开启桨叶进行短时间搅拌，其余时间关闭桨叶保持静态培养，如此循环数小时至一天，到接种完成后改为持续搅拌模式。间歇搅拌模式使细胞有充足时间在静止状态下贴附微载体，适合细胞贴附微载体速率较慢或接种密度较低的情况，已被广泛应用于间充质干细胞（MSCs）、多能干细胞（PSCs）、胚胎干细胞（ESCs）培养^[2]。

◆持续搅拌模式则更适合细胞贴附微载体速率较快的情况。一项针对VERO细胞在两款不同微载体表面贴附均匀度的研究显示，对于VERO细胞贴附速率更快的一款正电荷修饰的实心球型微载体，采用持续搅拌模式获得的细胞贴附均匀度优于间歇搅拌模式；而对于另一款细胞贴附速率较慢的基于ECM材料的多孔微载体，这一结论则正好相反^[5]。

由此可见，接种阶段的适宜搅拌模式受到细胞贴附速率、接种密度等参数的影响。而细胞贴附微载体速率又与贴附原理（如电荷吸附或细胞-ECM相互作用等）和微载体特点（如实心或多孔）有关。故应结合细胞、微载体的特点综合选择搅拌模式。

除搅拌模式外，搅拌速率也是影响细胞接种效果的重要因素。

◆ 细胞搅拌速率过低，微载体无法与细胞充分混合，细胞容易自发沉降结团，无法贴附均匀^[6]。

◆ 高搅拌速率，会增大细胞承受的剪切力，可能造成细胞损伤或其他应力诱导的细胞性质变化，影响细胞质量^[7]；同时，细胞在高剪切力作用下更易从微载体表面脱附^[6]。

故应在保证微载体可以充分动态悬浮的前提下，采用尽量温和的搅拌速率辅助接种。

Conclusion

微载体培养技术中的接种效果受到细胞状态、微载体浓度、细胞密度、细胞-微载体比例、搅拌模式与搅拌速率等多种工艺参数影响。

技术人员应充分了解细胞贴附微载体的基本原理，综合考虑细胞及微载体特性，选择适宜的接种工艺条件，以确保最优细胞培养效果。

Key Products 

华龛生物全系3D微载体

(点击可查看大图)