O抗原的合成发生在细胞膜的胞浆面，以膜结合脂（GCL）与 NDP-单糖结合为起始点，至新生O抗原在周质间隙面与core-LipidA连接成LPS为终止点。GCL又名脂质抗原载体（ antigen-carrie lipid，ACL），是一种十一异戊二烯醇（undecaprenola或prenol）单磷酸﹐它在细胞内合成并可进一步磷酸化。在细胞膜上，GCL、P-GCL和 PP-GCL间的磷酸化和去磷酸化维持一定的动态平衡，在О抗原的合成过程中发挥重要作用。
О-抗原合成途径分为两种下面介绍其中一种：O-抗原多聚化酶（Wzy）依赖型
此途径的第一步是在GCL上进行寡聚糖重复单位的合成，其主要特征是寡聚糖重复单位在胞浆面以GCL-PP形式合成，然后在О-抗原易位酶（Wzx）参与下转移至周质间隙面以进行重复单位的多聚化反应，多糖链向还原末端延伸，在非常接近膜的部位发生聚合，该反应需要Wzy催化。Wzy的调控基因若发生缺失，则只能形成结合一个重复单位的LPS（半粗糙型）。通过此途径合成的O-抗原均为异聚体（即重复单位由不同的糖基构成）。
1、O-抗原重复单位的合成
该步反应发生在细胞膜的胞浆面（图3-6）。如沙门菌属的三糖基本骨架，在磷酸化酶的作用下UDP-Gal与GCL-P反应形成GCL-PP-Gal和UMP。在通过两次糖基化反应是不同的NDP-单糖转移到Gal-PP-GCL上，形成三糖基本骨架。沙门菌О-抗原的三糖骨架重复单位的合成如下图：
GCL-PP-Gal在一系列糖基转移酶的催化下完成重复单位的合成。新合成的GCL-PP-重复单位作为一个整体从胞浆面转移至周质间隙面，此转运过程可能是在Wzx参与下完成的，Wzx是一种具有12个跨膜区域的疏水性蛋白质。在Wzy催化下，己经聚合的重复单位链被转位到新合成的GCI-PP-重复单位上（图3-6），因此多糖链的延长是在其还原端开始的。沙门菌О抗原多糖的聚合反应可以用下式表示：
重复单位的聚合发生在细胞膜的周质间隙面（图3-3，图3-6）。已转位出多聚体的PP-GCL在进行下一次重复单位合成前，须经过焦磷酸酶作用形成P-GCL才能再次进入循环。
沙门菌О-多糖重复单位的取代可表现出异质性，主要表现在O-抗原重复单位上单糖和（或）O-乙酰基取代基团的有无。例如鼠伤寒沙门菌О-特异多糖的半乳糖4位上被葡萄糖取代，从而形成О-抗原因子122，即在半乳糖上连接有以α-1，4键相联的葡萄糖。这是所谓的O-抗原修饰的典型例子。该反应需要一个葡萄糖脂中间物质的参与，这一物质己经被确定为β-Glc-P-GCL。
在连接酶Waal的作用下，О抗原在细胞膜的周质间隙面与core-Iipid A连接，形成完整的LPS分子。Waal是目前己知的惟一与连接反应有关的酶﹐能有效地把高分子量多聚体或低分子量寡聚体连接起来。Waal可同时识别О-抗原和core-Lipid A中的核心结构，目前对该连接酶的认识还较少。
大肠杆菌K-12的某些О-抗原重复单位与核心多糖相连的糖基为N-乙酰葡萄糖胺而非半乳糖。这类重复单位的合成是由对衣霉素敏感的UDP-GlcNAc：GCL-P-GlcNAc-1-P转移酶（WecA）催化起始反应的（图3-6），后续的重复单位合成和多聚化反应与沙门菌的相同。
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