Sapphire FL解决方案— 更高效，更准确！多重荧光的免疫组化成像

Azure中国

2024/07/08 17:12

免疫组织化学(IHC)是一种利用抗原抗体特异性结合，检测和定位组织样本中特定抗原或分子的技术。由于抗原的位置可提供关于其生物作用及组织完整性、发育阶段等信息，因此，IHC具有重要的基础研究价值，是疾病诊断和肿瘤分期的重要工具。

传统的IHC实验使用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的抗体进行显色检测，一次只能在载玻片上检测到一种抗原。而多重荧光检测技术（如Sapphire FL激光扫描成像系统）的应用，大大增强了载玻片上的信息获取，有效提高了诊断的准确性。

同时，Sapphire FL具有5-1000μm可调节的高分辨率，可快速筛选分类，挑选最好的切片进行显微分析，免于对所有切片进行显微镜成像观测的耗时繁琐。此外，Sapphire FL获取的完整载玻片图像，可对显微镜捕获的小切片图像进行补充。

— 实验案例：小鼠肺组织切片的IHC成像 —

使用Sapphire FL，对小鼠肺组织切片进行多重荧光IHC成像，对切片中的两种抗原进行检测。

材料与方法

1. 小鼠肺组织的制备

将小鼠肺组织的石蜡块切片置于载玻片上，60度烘烤45分钟。组织切片使用二甲苯和乙醇洗涤，进行脱腊、水化。分别使用二甲苯、100%乙醇、95%乙醇、70%乙醇和PBS洗涤2次，每次5分钟。

2. 抗原修复

脱腊及水化完成后，载玻片在Tris-EDTA Tween®缓冲液(pH 9)中，使用电饭锅孵育22分钟。随后等待20分钟，使载玻片回至室温后，在PBS中洗涤两次，每次10分钟。

3.免疫检测

为检测切片中的血管内皮(VE)钙粘蛋白和平滑肌肌动蛋白(SMA)，采用兔抗VE钙粘蛋白和小鼠抗SMA 为一抗。将组织切片在Power BlockTM 中封闭12分钟。使用含0.5% Triton的PBS缓冲液稀释一抗：兔抗VE钙粘蛋白抗体及小鼠抗SMA抗体的稀释比例分别为1:100和1:200。将载玻片与一抗冷藏孵育过夜。随后使用TBS洗涤两次，每次5分钟，再用TBS- tween®洗涤一次，除去未结合的一抗。

使用荧光标记的二抗，AzureSpectra山羊抗兔550 (Azure Biosystems产品#AC2158) 和AzureSpectra山羊抗鼠650 (Azure Biosystems产品#AC2166)对一抗进行检测。使用含0.5% TritonTM的PBS缓冲液对二抗进行1:500稀释。将载玻片置于二抗溶液中室温孵育1小时。

随后使用TBS洗涤两次，每次5分钟，再用TBS- tween®洗涤一次，洗去未结合的二抗，并盖上盖玻片进行成像。

4. 成像

使用532nm和638nm标准光学模块和扩展动态范围(EDR)功能，在Sapphire FL上对切片进行成像。聚焦类型选择Slide，将焦距设置在玻璃成像表面上方+1.00 mm。图像以5μm分辨率拍摄，质量设置为High（高）。

结果

图1. 小鼠肺组织切片探测血管内皮（VE）-钙粘蛋白（红色，AzureSpectra 550nm二抗）和光滑肌肉肌动蛋白（SMA）（绿色，AzureSpectra 650nm二抗）。使用Sapphire FL激光扫描成像系统在532nm和638nm通道下成像，分辨率5μm。

图1显示了Sapphire FL拍摄的多重荧光IHC实验图像。载玻片中的小鼠肺组织切片，使用VE-cadherin和SMA进行探针检测，并使用两种荧光标记的二抗进行检测。VE-cadherin使用Sapphire FL 532nm标准光学模块检测，在图像中显示为红色。SMA使用Sapphire FL 638nm标准光学模块检测，在图像中显示为绿色。在5μm分辨率图像中可很容易地观察到组织形态。在图1中，肺组织区域被放大，局部SMA染色可更详细地可视化。

结论

使用Sapphire FL可对荧光标记的肿瘤，轻松实现可视化。同时对于未被标记的肿瘤，也可实现高品质的成像检测。

Sapphire FL具有集成的麻醉端口，搭配合适的导管和鼻锥，即可实现活体小鼠的麻醉成像；高达4cm的样品仓，支持小鼠、植物、培养皿及其它大型生物样品成像。除荧光成像外，Sapphire FL还可灵活实现近红外荧光、磷屏、化学发光及可见光的多功能成像应用，赋能实验室多样化、更深入的科研需求！

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