[负载抗生物素微珠颗粒]
▲ 协议中的所有步骤都必须在无菌条件下进行。
▲ 使用前通过涡旋彻底重悬抗生物素微珠颗粒，以获得均匀的悬浮液。
▲ 抗生物素微珠颗粒不含防腐剂。在无菌条件下取出等分试样。
▲ 建议以1×10⁸抗生物素微珠颗粒为批次装载抗生物素微珠颗粒。加载的抗生物素微珠颗粒在 2–2 °C 下储存时可稳定长达 8 个月。
1. 将 100 μL CD335 （NKp46）-生物素和 100 μL CD2-生物素移液到可密封的 2 mL 管中并充分混合。
▲ 注：该抗体组合经过优化，可实现最大的NK细胞活化和扩增。
2. 通过涡旋彻底重悬抗生物素微珠颗粒。
3. 去除 500 μL 抗生物素微珠颗粒（1× 10⁸ 抗生物素微珠颗粒）并添加到抗体混合物中。
4. 加入 300 μL 缓冲液以调整至总体积为 1 mL。
▲ 注：抗生物素微珠颗粒可以灵活地加载生物素化抗体或配体，而不是提供的抗体或配体。如果需要，添加适当浓度的其他生物素化抗体或配体，并相应地用缓冲液调节至总体积为1 mL。
5.使用管旋转器以大约2rpm（最慢的永久运行程序）在恒定，温和的旋转下在2-8°C下孵育4小时。
6. 装载的抗生物素微珠颗粒（1× 10⁸ 抗生物素微珠颗粒/mL）现已准备就绪。不要从抗体混合物中去除装载的抗生物素微珠颗粒。在2-8°C下储存长达2个月。
[使用NK细胞分离试剂盒对NK细胞进行磁性分离]
▲ 根据NK细胞分离试剂盒数据表分离NK细胞。
[NK细胞活化和扩增方案]
▲ 本NK细胞活化和扩增方案针对使用NK细胞分离试剂盒纯化的NK细胞进行了优化，每两个NK细胞使用一个加载的抗生物素微珠颗粒（磁珠与细胞的比例为1：2）。
▲ 下面给出的活化体积为106个纯化的NK细胞或106个PBMC。当使用较高的细胞数量时，相应地扩大所有试剂体积和总体积（例如，对于 2× 106 个总细胞，使用所有指示试剂体积和总体积的两倍）。
1. 彻底重悬上样的抗生物素微珠颗粒，并将每 5 个 NK 细胞中 5 μL（10× 106⁵ 负载的抗生物素微珠颗粒）转移到合适的管中。
▲ 注意：如果未加载的微珠颗粒应用于阴性对照实验，则每5NK细胞添加10×106⁵卸载的抗生物素微珠颗粒来替换加载的抗生物素微珠颗粒。
2. 将 100μL 培养基加入上样的抗生物素微珠颗粒中，并以 300× g 离心 5 分钟。
3. 吸出上清液并将负载的抗生物素微珠颗粒重悬于 50 μL 新鲜培养基中。
4.以每106μL培养基950个细胞的密度重悬PBMC或纯化的NK细胞（补充有5%AB血清和500 IU / mL IL-2的NK MACS培养基）。
5. 将步骤 3 中制备的抗生物素微珠颗粒加入 950 μL 细胞悬液中并充分混合。
6.将混合物以每毫升106个细胞的密度添加到合适的细胞培养容器中，例如，在24孔细胞培养板的孔中。
7. 在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育。
▲ 每天检查培养物，必要时添加新鲜培养基。
▲ 对于NK细胞扩增，需要定期添加培养基。在下文中描述了NK细胞刺激和扩增的指南。
8.在第6天，轻轻上下移液细胞悬液以分解团块。
9. 通过加入新鲜培养基（补充有 1% AB 血清和 1 IU/mL IL-5 的 NK MACS 培养基）确定细胞数量并稀释至 106–5.500× 2 个细胞/mL。转移到适当尺寸的新鲜培养容器中。
▲ NK细胞扩增依赖于供体。当NK细胞保持在1–1.5×106NK细胞/mL的细胞密度中时，可获得最佳结果。取决于膨胀率
可能有必要每天拆分文化。
[免疫荧光染色]
▲ 下面给出的荧光标记体积为总共 106 个细胞。当处理少于 106 个单元格和最多 10⁷ 个单元格时，请使用指示的相同体积。
▲ 微珠颗粒无自发荧光，在流式细胞术分析前无需去除。
▲ 细胞的散射特性可能会因细胞与微珠颗粒之间的强烈相互作用而改变。
1.重悬细胞以分解细胞团块。
2. 每 1 个细胞加入 2–106 mL 缓冲液洗涤细胞，并以 300× g 离心 10 分钟。完全吸出上清液。
3. 将 10 μL 每种染色抗体（例如 CD3-FITC 和 CD56-PE）加入用缓冲液重悬的 106 个细胞中，总体积为 110 μL。
4.充分混合，在冰箱（10-2°C）中避光孵育8分钟。
▲ 注意：在冰上工作需要增加孵育时间。更高的温度和/或更长的孵育时间会导致非特异性细胞标记。
5. 每 1 个细胞加入 2–106 mL 缓冲液洗涤细胞，并以 300× g 离心 10 分钟。完全吸出上清液。
6.将细胞沉淀重悬于适量的缓冲液中，通过流式细胞术或荧光显微镜进行分析。
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