[样品制备]
当使用抗凝外周血或血沉棕黄层时，应通过密度梯度离心分离外周血单核细胞（PBMC），例如使用Ficoll。
▲注意：为了在密度梯度分离后去除血小板，将细胞沉淀重悬于缓冲液中，并在200°C下以10×g离心15-20分钟。 小心吸出上清液。重复洗涤步骤。
处理组织或裂解的血液时，使用标准方法制备单细胞悬液。有关详细信息，请参阅相应分隔符用户手册的“通用协议”部分。
▲ 死细胞可能与微珠非特异性结合。要去除死细胞，我们建议使用密度梯度离心或死细胞去除试剂盒。
[磁性标签]
▲ 快速起效，保持细胞低温，使用预冷溶液。这将防止抗体在细胞表面封顶和非特异性细胞标记。
▲ 下面给出的磁性标记体积最多为10⁷个总细胞。当处理少于 10⁷ 个细胞时，请使用与指示相同的体积。当使用较高数量的细胞时，相应地扩大所有试剂体积和总体积（例如，对于 2× 10⁷ 个总细胞，使用所有指示试剂体积和总体积的两倍）。
▲ 为了获得最佳性能，在磁分离之前获得单细胞悬液非常重要。将细胞通过30μm尼龙网（预分离过滤器）以去除可能堵塞色谱柱的细胞团块。使用前用缓冲液湿滤。
▲ 在冰上工作可能需要增加孵育时间。更高的温度和/或更长的孵育时间可能导致非特异性细胞标记。
1.确定手机数量。
2.将细胞悬液以300×g离心10分钟。完全吸出上清液。
3.将细胞沉淀重悬于每 80⁷ 个总细胞的 10 μL 缓冲液中。
4.每 20⁷ 个总细胞添加 45 μL CD10 微珠。
5.搅拌均匀，在冰箱（15−2°C）中孵育8分钟。
6.（可选）加入染色抗体，例如10μLCD45-FITC在冰箱（5−2°C）中在黑暗中孵育8分钟。
7.每 1 ⁷ 细胞加入 2− 10 mL 缓冲液，并以 300 × g 离心 10 分钟，洗涤细胞。完全吸出上清液。
8.在 10 μL 缓冲液中重悬多达 500⁸ 个细胞。
▲ 注意：对于更高的细胞数量，请相应地增加缓冲液体积。
▲ 注意：对于用LD柱去除，在1μL缓冲液中重悬至25.10×500⁸细胞。
9.进行磁选。
[磁选]
▲ 根据总细胞数和CD45细胞数选择合适的色谱柱和分隔符。+
使用 MS 或 LS 色谱柱进行磁分离
1.将色谱柱放置在合适的分离器的磁场中。有关详细信息，请参阅相应的色谱柱数据手册。
2.用适量的缓冲液冲洗制备色谱柱：
质谱：500 微升 LS：3 毫升
3.将细胞悬液涂在色谱柱上。
4.收集通过的未标记细胞，并用适量的缓冲液洗涤色谱柱。收集全部污水;这是未标记的细胞部分。通过添加缓冲液三次来执行洗涤步骤。仅当色谱柱储液槽为空时才添加新缓冲液。
质谱：3× 500 μL LS：3× 3 mL
5.从分离器中取出色谱柱，并将其放在合适的收集管上。
6.将适量的缓冲液移液到色谱柱上。通过将柱塞牢固地推入色谱柱中，立即冲洗出磁性标记的细胞。
质谱：1 毫升 LS：5 毫升
7.（可选）为了提高CD45细胞的纯度，洗脱级分可以在第二根MS或LS柱上富集。使用新色谱柱重复步骤1至6中所述的磁性分离过程。+
使用 XS 色谱柱进行磁分离
有关色谱柱组件和分离的说明，请参阅XS色谱柱数据手册。
LD色谱柱的耗尽
1.将LD柱放置在合适的分离器的磁场中。
2.用2 mL缓冲液冲洗制备色谱柱。
3.将细胞悬液涂在色谱柱上。
4.收集通过的未标记细胞并用2×1 mL缓冲液洗涤色谱柱。收集全部污水;这是未标记的细胞部分。通过添加缓冲液两次来执行洗涤步骤。仅当色谱柱储液槽为空时才添加新缓冲液。
CS色谱柱的耗尽
1.组装CS柱并将其放置在合适的分离器的磁场中。
2.通过填充并用60 mL缓冲液冲洗来制备色谱柱。将 22G 流量电阻器连接到组装柱的 3 路旋塞阀上。
3.将细胞悬液涂在色谱柱上。
4.收集通过的未标记细胞，并从顶部用30 mL缓冲液洗涤色谱柱。收集全部污水;这是未标记的细胞部分。
D 柱耗尽
有关色谱柱组装和分离的说明，请参阅D色谱柱数据手册。
使用分离器进行磁选
▲ 用于操作分离器的缓冲器的温度应≥10°C。
▲ 程序选择取决于分离策略、磁性标记强度和磁性标记细胞的频率。有关详细信息，请参阅相应用户手册中描述细胞分离程序的部分。以下计划建议是指分离富含白细胞的血沉棕黄层。
使用分离器进行磁选
1.准备并启动仪器。
2.应用含有样品的试管，并提供用于收集标记和未标记细胞组分的管。将样品管放在摄取端口处，将馏分收集管放在端口 neg1 和端口 pos1 处。
3.对于标准分离，请选择以下程序之一：
正向选择：“波塞尔”
从出口端口 pos1 收集正馏分。
耗尽：“耗尽”
从出口端口 neg1 收集负分数。
工商信息
信息已认证
