相干拉曼散射显微成像系统的应用举例

相干拉曼散射显微成像系统的应用举例

相干拉曼散射成像原理

传统拉曼的产生需要一束泵浦光（pump），然后会产生波长不同的斯托克信号（stokes）或反斯托克信号（anti-stokes），但是由于自发拉曼的信号微弱，采集时间需要几十分钟甚至是几个小时。

相干拉曼技术利用共振来放大需要检测的拉曼信号，需要同时输入两束光，除了泵浦光外，还需要与斯托克斯光同频率的入射光来产生共振；此时泵浦光能量往往会因为受激拉曼散射效应而减弱，而斯托克斯光能量则会被放大，这两种现象又分别被称为受激拉曼损耗（stimulated Raman loss, SRL）和受激拉曼增益（stimulated Raman gain, SRG），二者都属于受激拉曼散射范畴。此外还会产生一个新频率信号称为相干反斯托克斯拉曼散射CARS。

因此，相干拉曼具有两种形式，SRS和CARS。通过上述方法拉曼信号被放大，极大提升了图像信噪比和成像分辨率，而且也能做到无标记成像

细胞代谢，Zhang, L. et al. Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism. Nat Biomed Eng 3, 402–413 (2019).

通过小鼠饮用含氘代葡萄糖的水可以在组织切片中通过SRS成像检测到特异条带2150cm-1，在后续代谢过程中可以在各个组织中检测到CD键的信号，例如肌肉，心脏，胰腺，肾脏，十二指肠和fat pad中。而且不同浓度的氘代葡萄糖的SRS信号随时间变化基本为线形，提供了量化的可能。而且可以拍摄时间序列图像追踪动态变化过程。

基于SRS化学成像的高通量菌株分析的流程示意图

菌落中单菌的产量探测和分析

Tague, N. et al. Longitudinal single-cell chemical imaging of engineered strains reveals heterogeneity in fatty acid production. 2021.07.26.453865 Preprint at https://doi.org/10.1101/2021.07.26.453865 (2022).

脂肪酸及其衍生物是高需求化学品，可用于燃料、大宗商品和特种化学品。这里通过纵向高光谱SRS方法来研究代谢工程的大肠杆菌，检测活细胞中游离脂肪酸的产生和组成。由于SRS能够在单细胞水平测量产量，因此我们研究了脂肪酸生产菌株的异质性，并观察到集落水平的异质性和产量方面的显著细胞间差异。我们优化了成像参数，使纵向高光谱SRS成像能够捕获生长细胞随时间推移的脂肪酸生成。接下来，我们使用纵向测量来证明同一菌株内脂肪酸产生和组成的动态差异。据我们所知，这是首次对多个细胞周期的活细胞进行纵向高光谱SRS成像。最后，我们将SRS显微镜与延时相位对比显微镜和自动分割分析配对，以检查生产和生长之间的关系。

脂质在癌细胞中累积

Yue, S. et al. Cholesteryl Ester Accumulation Induced by PTEN Loss and PI3K/AKT Activation Underlies Human Prostate Cancer Aggressiveness. Cell Metabolism 19, 393–406 (2014).

通过SRS成像和HE对比发现，对于前列腺癌患者的腺体内富含脂质，进一步分析发现这些脂质为胆固醇酯，而正常前列腺组织内为为酯化的脂质和蛋白。通过相干拉曼显微镜对人类患者癌组织中的单细胞水平的脂肪生成进行了定量分析，发现前列腺癌中所有阶段均富含胆固醇酯，表明胆固醇酯是人类前列腺癌组织中中性脂质的主要形式，可以作为前列腺癌诊断的分子标记物。

使用多色受激拉曼散射显微镜进行病理学成像

Lu, F.-K. et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences 112, 11624–11629 (2015).

Ji, M. et al. Rapid, label-free detection of brain tumors with stimulated Raman scattering microscopy. Sci Transl Med 5, 201ra119 (2013).

受激拉曼散射（SRS）显微镜的无标记DNA成像方法，可用于活体动物和完整新鲜人体组织中的细胞核；通过对鳞状细胞癌（SCC）进行SRS成像发现癌细胞的染色体具有更强的信号和固缩的染色体独特形态（图中黄色箭头），而且癌细胞聚集和周围正常细胞相比具有明显的界限，可用于癌症边缘诊断。

通过单个细菌中 D2O 代谢的来确定尿液和全血中细菌的药物敏感性

Zhang, M et al.  “Rapid Determination of Antimicrobial Susceptibility by Stimulated Raman Scattering Imaging of D2O Metabolic Incorporation in a Single Bacterium. ” Adv. Sci. 2020, 7, 2001452.

相比于传统的药物敏感性测试，使用相干拉曼成像方式进行药敏试验仅需2.5小时既可以确定结果，而且能够测定尿液或全血环境中细菌的代谢活性和易感性，未来可用于临床快速抗菌药敏试验。

斑马鱼作为癌症研究模型对脂质代谢的影响

Andreana, M. et al. Toward Quantitative in vivo Label-Free Tracking of Lipid Distribution in a Zebrafish Cancer Model. Frontiers in Cell and Developmental Biology 9, (2021).

模式动物作为在体研究和药物研发的重要手段，相干拉曼的无标记无损成像方式能够帮助研究员对肿瘤成因和药物作用进行深度和在体研究。除了斑马鱼，小鼠，线虫，文昌鱼等模式动物都可以运用相干拉曼技术进行原位代谢研究。

多光谱拉曼对线虫中脂质代谢成像

Wang, P. et al. Imaging Lipid Metabolism in Live Caenorhabditis elegans Using Fingerprint Vibrations. Angew Chem Int Ed Engl 53, 11787–11792 (2014).

多组学分析 Ge, X. et al. SRS-FISH: A high-throughput platform linking microbiome metabolism to identity at the single-cell level. Proceedings of the National Academy of Sciences 119, e2203519119 (2022).

通过将SRS与FISH结合，利用 SRS 的优势进行单细胞稳定同位素探测，并结合 FISH 以高通量方式识别细胞。实现新陈代谢与细菌身份之间直接联系。

相干拉曼在材料科学的应用领域

Cheng, Q., Miao, Y., Wild, J., Min, W. & Yang, Y. Emerging applications of stimulated Raman scattering microscopy in materials science. Matter 4, 1460–1483 (2021).

SRS具有许多独特的优点，这些特征使SRS适合于材料研究，并使我们能够跟踪在快速变化的环境中化学浓度的动态变化。现有的研究包括材料表面分析，离子传输，化学反应，气溶胶，矿物，环境污染物，药片分析，界面研究，药物递送和沸石等等。

药物成分分析 Slipchenko, M. N. et al. Vibrational imaging of tablets by epi-detected stimulated Raman scattering microscopy. Analyst 135, 2613–2619 (2010).

药物剂型由各种成分的混合物组成，以产生理想的药物传递特性。片剂是由活性药物成分（API）和辅料的混合物制成的，通常是粉末，压缩成固体形式。片剂的形成过程代表了制药行业下游加工的最后一个阶段，对生产具有相同特性的配方至关重要。在药物浓度较低的情况下，很难控制含量的均匀性。片剂内活性成分和辅料的不均匀分布可能会改变释放谱，这可能对患者有害。因此，能够绘制原料药和辅料分布图的成像技术对于生产高质量的片剂配方至关重要。

来自不同制造商的的苯磺酸氨氯地平（AB）（红色）片通过SRS成像研究其化学组分。这些药片中含有5毫克的原料药。除Apotex外，所有样品中的沉淀物均由微晶纤维素（MCC）（绿色）、无水二碱性磷酸钙（DCPA）（蓝色）、淀粉乙醇酸钠（SSG）（黄色）和硬脂酸镁（MS）（品红）组成。

3D 图像显示在锂电极表面附近的离子耗尽

Cheng, Q. et al. Operando and three-dimensional visualization of anion depletion and lithium growth by stimulated raman scattering microscopy. Nat Commun 9, 2942 (2018).

3D 图像显示在 4.2 mA cm-2的电流密度下锂表面附近的离子耗尽。Li 电极附近透明区域（白色）的扩展表明电极附近的Li +离子逐渐耗尽。通过相干拉曼不仅可以实现电极表面的分析，还可以进行3D成像。

总是，由于SRS是无背景的，因为它直接探测激光场与化学键之间的能量交换。与其他相干拉曼散射显微镜，如相干反斯托克斯拉曼散射相比，SRS信号不受非共振背景的影响，如果峰值位置不随浓度的变化，通常与化学键的浓度成正比。这大大地简化了数据解释和便于量化。与SERS样品必须被金属表面吸附不同，SRS不需要任何基质。来自SERS效应的增强因子差异很大，使得其不太适用于成像。相比之下，SRS可以忠实地询问光谱细节，同时显示出巨大的线性浓度依赖性。这些特征使SRS适合于各种方面的研究。