皮肤屏障完整性评估：电阻抗测量与经皮水分测量的综合考量

体外透皮试验（IVPT）可用于评估药物到达皮肤作用部位或附近的速率和程度，或评价药物经皮渗透并进入体内的行为，模拟药品在生理条件下的透皮过程。在IVPT研究过程中，需要使用离体的人或动物皮肤模型来进行实验，皮肤的质量关系着实验结果的可靠性和重复性，正因如此，FDA、EMA、CDE等在相关法规中规定需要在实验前对皮肤屏障完整性进行测试^【1,2,3】。FDA工业指南中推荐经皮水分散失（TEWL）法和电阻/电导值法作为常用的皮肤屏障完整性测试方法^【1】。

TEWL是通过测定皮肤外表面附近的水分，来评估水分从皮肤下侧通过皮肤屏障的速率。在测定时，将皮肤安装到扩散池中，使皮肤下侧与接收室中的接收介质接触，然后将皮肤表面温度平衡至32℃±1℃后进行测量。电阻抗法则是通过将少量的离子溶液（足以覆盖皮肤切片的整个表面）短暂的施加到皮肤角质层上，然后将电阻测试仪的一端电极与接收室中溶液接触，而另一端电极与供给室中溶液接触，进行电阻的测量。

商业化的TEWL 测量仪器，其设计和操作原理各不相同。由于设计的差异，一些TEWL测量仪器可能相对更容易受到环境条件的影响（如开放式腔室与封闭式腔室相比）^【4】，通常需要尽可能精确的控制环境的温度和湿度。此外，我们在日常的实验过程中还发现，不同厂家的TEWL设备，其探针室直径、深度、适配器规格等均不相同，这也导致在测量同一皮肤样品的TEWL时，数值差异较大，无可比性，给实验人员带来很大困扰。

而跨膜电阻（TEER）皮肤屏障完整性测试的结果，可能因电阻测试仪表设置（如频率）和所用的测试技术方法不同，产生很大变化。FDA相关资料（详情请点击链接查看）中指出，电阻值低于基准值（无皮肤膜，介质溶液读数）3倍的皮肤由于其屏障受损应被排除在研究之外；同理，电阻读数高于基准电阻的20倍的皮肤，因具有角化的上皮层，也应该被排除在研究之外。

（1）受试者准备：清洁受试者待测皮肤区域，去除化妆品和油脂。

（2）仪器校准：根据仪器说明书进行校准，确保测量准确性。

（3）测量过程：使用3种仪器分别测量志愿者待测经皮失水值，在受试者待测皮肤位置用马克笔标注测量区域，每次测量后将仪器探头平衡归零再进行下一次测量，共进行多次测量。

（4）对数据进行对比总结。

（1）3个扩散池为一组，共分为三组。将纯水加入扩散池中，加到刻度线，保持液面高度一致，用堵头封住扩散池嘴，于32℃的水浴锅中平衡半小时。

（2）采用加垫圈的方式控制仪器探测器到液面的高度。第一组扩散池加2个2mm厚度垫圈；第二组扩散池加4个2mm厚度垫圈；第三组扩散池加6个2mm厚度垫圈；

（3）用3个不同品牌的经皮水分流失测量仪分别测量三组扩散池中纯水的TEWL值，记录测量数据，每个扩散池平行测量3次。

（4）整理实验数据，将测得的TEWL值进行对比分析

（1）将纯水加入3个扩散池中，加到刻度线，保持液面高度一致，用堵头封住扩散池嘴，于32℃的水浴锅中平衡半小时。

（2）用游标卡尺分别精确测量扩散池中纯水液面到扩散池口的高度，以及经皮水分流失测量仪探测器到扩散池卡口的高度，相加即得液面到探测器的实际高度。

（3）采用加垫圈的方式调节仪器探测器到液面的高度，每增加一个垫圈，该高度增加2mm。3个扩散池分别依次增加1、2、3、4、5个2mm厚度垫圈。

（4）分别用3个不同品牌的经皮水分流失测量仪测量3个扩散池每增加一个垫圈的TEWL值，并记录数据，平行测量3次。

（1）从同一供体处采集巴马小香猪皮肤样本，记录皮肤的位置，并处理成直径25mm，厚度约1.0mm皮肤切片。

1、人体各部位经皮失水值测量

对数据进行统计分析，计算每种仪器测量不同受试者不同皮肤区域的平均值，结果如表1所示：

横向对比表中3个不同品牌的仪器测量值，可以发现ASCH在同一受试者同一皮肤区域测量值相对高出Skin Tes和VapoMeter的测量数值较多。考虑到受试者个体之间的差异，我们接下来的实验统一采用纯水进行TEWL值的测量。

2、3个品牌TEWL测量仪器测量值对比

用增加垫圈的方式控制仪器探测器到液面的高度，分别用3个品牌的经皮水分流失测量仪测得的数据结果如图1所示。由图可知，在探测器到液面的高度分别增加2mm、4mm、6mm时，3款仪器测量所得的TEWL值均呈现降低的趋势；在探测器到液面的高度不变的情况下，瑞士SKT所测得数值最小，芬兰Delfin测得的数值与瑞士SKT接近，日本ASCH所测得的数值最大，且与其他两款仪器相差较大。

图1. 不同品牌TEWL测量仪器测量值对比图

3、探测器高度与TEWL值的关系

根据上述实验结果，我们可以发现探测器到液面的高度可能与TEWL的测量结果有某种潜在关系，因此，我们又设置了5个不同的探测器到液面高度，并使用游标卡尺对探测器到液面高度进行了精确测量，然后分别用3款经皮水分流失测量仪读取相应的数值。

分别绘制瑞士SKT、芬兰Delfin、日本ASCH经皮失水测量值与传感器到液面高度关系曲线如图2、图3、图4所示，由图可知，3款仪器所测得经皮失水值均与传感器到液面高度呈现负相关，计算得到的R²均大于0.9，表明经皮失水值与传感器到液面高度之间存在较强的线性相关关系。

图4. 经皮失水-传感器到液面高度曲线（ASCH）

4、电阻抗法用于皮肤完整性的评估

表2皮肤厚度、TEWL值、电阻抗数据

表3 剥离角质层（SC）后皮肤厚度、TEWL值、电阻抗数据

图6. 剥离和未剥离角质层（SC）的皮肤累积渗透量均值随时间变化曲线

通过上面的实验，我们发现不同品牌的经皮失水测量仪在测量同一受试者相同皮肤区域时，结果相差较大。同样的，对于纯水样品，3个品牌的经皮失水测量仪所得到的结果数据仍然具有巨大的差异。探测器到液面的高度可能是TEWL测量的其中一个影响因素，我们通过实验证实了这一猜想，实验结果表明，经皮失水测量值与传感器到液面高度之间存在较强的线性相关关系。

在过往的探究中我们曾发现，相同的生物膜在不同扩散池中的绝对电阻值不同，但与空白介质溶液相比，其电阻的倍数值重现性良好；通过上述电阻抗法用于皮肤完整性评估实验结果，我们可以得到一致的结论：电阻抗倍数值可用于准确评估皮肤屏障完整性。

虽然经皮水分流失（TEWL）测量法和电阻抗法均为法规所推荐的皮肤屏障完整性检测方法，但在实际的测量过程中，我们发现，当天气晴朗时我们所测得的TEWL值与阴雨天气所测得的TEWL相差较大；室内温度不同时所测得的TEWL值亦是如此。TEWL的测量影响因素除了温度、湿度、探测器位置，还有空气流通、光源、零点漂移等因素^【6】。如此多的影响因素都会干扰我们对TEWL值的测量，间接影响IVPT试验的可靠性和重复性。而皮肤电阻抗与空白介质溶液电阻抗的倍数值其重复性较好，似乎更适合用来进行皮肤屏障完整性评估。

经皮水分流失（TEWL）测量法已被广泛应用于皮肤屏障完整性测试，但是我们目前并没有看到IVPT试验相关的官方的TEWL测试指导性文件。因此，我们在此呼吁相关部门尽快出台IVPT试验相关的TEWL测试指导性文件，以及TEWL测量仪器的检验标准、校准标准，以推动透皮制剂研发的规范性。