OFM微灌流-首次用于活体小鼠清醒状态大分子研究

血脑屏障（BBB）由内皮细胞、周细胞和星形细胞胶质板组成，可以防止有害物质从血液进入脑组织，是维持中枢神经系统(CNS)微环境的重要选择性屏障。然而，BBB的存在严重限制了血液循环中大分子的通过，导致外周给药的生物制剂进入CNS的浓度无法发挥治疗作用。据估计，血液循环大分子对CNS的暴露仅为0.1-0.4%。因此，研究人员致力于开发能调节或绕过BBB递送治疗药物的方法，其中受体介导的胞吞作用(RMT) 是一种很有前景的策略。RMT利用内皮细胞的囊泡运输机制将多种必需营养素（如转铁蛋白和胰岛素）运输到大脑。最近，Wouters等人(2020)发现了一种小鼠抗转铁蛋白受体纳米抗体，能够通过RMT将生物活性肽递送到小鼠的大脑中。

在潜在CNS药物的开发过程中，准确测量药物在作用部位的浓度是至关重要的一部分。微透析和脑开放式微灌流（cOFM）等技术被开发出来，用于直接从脑间质液中采集分子样本。微透析技术使用带有半透膜的探针，可以从脑间质液中连续采集内源性和外源性化合物，主要用于神经递质及其他小分子的采集，对于高分子量物质的采样具有局限性。最近，截留分子量为100 kDa至3 MDa的探针已经被开发出来，这种探针可以透过分子量较大的化合物，其物质交换基于超滤原理，通过对流扩散，采用推拉泵系统来控制液体流路。然而，由于压力波动，此类探针的采样仍具有挑战性。为解决这一问题，Takeda等人（2011）引入了一种带有通气孔的探针组件（AtmosLM™），可以使探针内的压力差迅速与大气压平衡。微透析实验通常在有限的时间内进行，在大多数已发表的研究中，实验在探针植入16-24小时后开始，根据BBB的功能和胶质疤痕组织的形成情况，持续时间最长为48-72小时。

图1. A. 脑开放微灌流（cOFM）和 B. 微透析 AtmosLM™ 的体外实验设置。BSA：牛血清白蛋白，MR：改良林格氏液，RBG：增益回收，RBL：损失回收。

图2. A脑开放式微灌流(cOFM)和B微透析AtmosLM™的体内实验时间表。5-HT：5-羟色胺，FITC-葡聚糖：异硫氰酸-葡聚糖荧光素，GABA: γ-氨基丁酸，VHH：纳米抗体。

对于这两种探针，在实验结束时，沿着植入轨迹的邻近区域可以看到星形细胞和小胶质细胞反应，这可能会影响回收率。此外，我们可以得出结论，在植入cOFM（脑开放式微灌流）探针超过14天后，与仅植入约3天的微透析探针相比，组织反应仅略显著。这证实了cOFM（脑开放式微灌流）探针在小鼠大脑中植入的更长时间是可能的。cOFM（脑开放式微灌流）探针采用生物相容性材料替代AtmosLM导管的金属材料，可能会显著减少在测试期间观察到的神经炎症反应。

为了深入了解探针植入对BBB完整性的影响，实验结束时，在探针轨迹周围给予FITC-葡聚糖，并测量荧光强度。使用分子量为40 kDa的FITC-葡聚糖，是因为它的分子量接近双特异性纳米抗体(±31 kDa)。此外，对冠状脑切片进行小鼠抗IgG抗体染色。结果与阳性对照进行了比较(见图4)。

表1 体外相对回收率(mean±SEM)

如图6所示，数据波动较大，除了生物变异性外，可能是因为一些数据点位于定量检测方法的下限以下，因此在部分动物中无法定量检测到纳米抗体。

本研究评估了cOFM（脑开放式微灌流）和微透析（AtmosLM™，截留分子量1 MDa）在小鼠中采集脑穿透性双特异性纳米抗体（约31 kDa）的适用性。通过评估神经炎症反应、BBB完整性、体外回收率和体内AUC来比较两种方法的性能。对于cOFM（脑开放式微灌流），这是第一次在清醒、自由移动的小鼠中进行的研究，得到了小鼠大脑炎症和BBB完整性的数据。免疫组化染色显示，在这两种探针的植入轨迹附近，都有星形细胞和小胶质细胞反应。冠状面切片显示，与cOFM（脑开放式微灌流）相比，微透析探针轨迹周围有更高的FITC-葡聚糖和IgG外渗，但与BBB被破坏的阳性对照相比，这种外渗非常有限。根据实验结果，我们建议在使用cOFM（脑开放式微灌流）探针进行BBB研究时，延长预运行阶段的时间。

这是首次在脑间质液中采集双特异性纳米抗体随时间变化的研究，展示了CNS中纳米抗体的药代动力学特征。这项研究表明，在考虑生物分析因素的前提下，微透析和cOFM（脑开放式微灌流）均适用于CNS中纳米抗体定量的体内采样技术。