导读:研究工作结合双功能激光可裂解探针和 iMScope TRIO 质谱成像显微镜实现对不同组织表面聚糖变化的可视化分析。
基于双功能激光可裂解探针和iMScope TRIO质谱的组织表面聚糖成像研究
Bifunctional cleavable probe for in-situ multiplexed glycan detection and imaging using mass spectrometry
Wen Maa, Shuting Xua, Honggang Nieb, Bingyang Huc, Yu Bai*a, and Huwei Liua
a.Beijing National Laboratory for Molecular Sciences, Key Laboratory of Bioorganic Chemistry and Molecular Engineering of Ministry of Education, College of Chemistry and Molecular Engineering, Peking University, Beijing 100871, P. R. China.
b.Analytical Instrumentation Center, Peking University, Beijing, 100871, P. R. China.
c.Institute of Hepatobiliary Surgery, Hospital of Hepatobiliary Surgery, Chinese People’s Liberation Army General Hospital, Beijing 100853, P. R. China.
细胞表面的聚糖不仅参与了一系列重要的生物学过程,糖基化程度的异常变化还与各类肿瘤的发生发展密切相关。因此,建立针对聚糖的高灵敏、高特异性检测及可视化识别方法对揭示肿瘤演进过程中的关键分子变化、研究早期瘤变的病理基础、发现新的肿瘤分子标志物尤为重要。目前针对聚糖的原位分析多采用荧光法和电化学法。然而,由于光串扰和生物基体背景干扰等原因,荧光法较难在一个体系中实现对多种聚糖的同时分析;电化学法则无法提供聚糖的空间分布信息。质谱由于其具有高分辨率、可提供分子结构信息、易于实现多组分同时检测和强大的定性定量能力,可实现生物组织表面聚糖的原位分析和微观结构信息的直接获取。研究工作结合双功能激光可裂解探针和 iMScope TRIO 质谱成像显微镜实现对不同组织表面聚糖变化的可视化分析。
1. 双功能探针的构建及其质谱表征
本工作设计了一种双功能激光可裂解质谱探针(LCMPs),结合激光解吸附离子化质谱(LDI-MS)技术,提出了一种原位、灵敏、多目标同时分析的聚糖检测和成像方法(图 1)。LCMPs 可通过简单、普适性的合成路线制备,其中探针上结合的不同凝集素(ConA,SNA,WGA 凝集素)能分别特异性地识别组织或细胞表面的甘露糖,唾液酸和 N-乙酰葡萄糖胺,而探针上修饰的大量聚乙二醇类质谱标签则具有质谱信号放大作用。该方法将对组织表面不同聚糖的检测转化为对大量质谱标签的检测,克服了直接检测聚糖时的离子化效率低、质谱图复杂等问题。
图 1 (A)普适性合成法构建 LCMPs (B)基于 LDI-MS 的聚糖检测方法
探针的双功能性质表现在其既能用于识别细胞或组织表面的聚糖,还可同时作为 LDI-MS 检测中的优异基质,无需额外喷涂基质即可直接用于细胞检测和组织成像研究。图 2 给出了在 iMScope TRIO 质谱成像显微镜激光的作用下,特异性识别甘露糖的双功能探针 LCMP1 (Au@ConA-tag1)的特征质谱图,其特征质谱信号为
m/z=957.587。
图 2 iMScope TRIO 质谱成像显微镜激光作用下 LCMP1 的特征质谱图
2. 基于 iMScope TRIO 质谱成像显微镜的组织成像实验
不同肿瘤的发生发展往往伴随着细胞表面聚糖含量的变化,结合独特设计 LCMPs,利用 iMScope TRIO 质谱成像显微镜实现对患者新鲜组织表面不同聚糖的可视化研究。肝细胞癌(HCC)-癌旁组织切片固定在氧化铟锡(ITO)导电玻璃上,用于质谱成像研究。一部分切片用于 HE 染色,另一部分连续切片则用于质谱成像分析。HE 结果显示在中分化肝细胞癌组织中观察到细胞核异形性,出现核变大和排列紊乱的现象(图 3 中区域3)。此外,iMScope TRIO 质谱成像结果显示同一组织中的不同病理变化伴随聚糖含量的变化,例如,在肝坏死区域几乎没有聚糖的表达,但在肝炎和肝癌的区域,唾液酸和甘露糖均出现高表达(图 3)。除此之外,图 4 展示了利用 iMScope TRIO 质谱成像显微镜对结直肠癌旁组织表面的甘露糖和唾液酸成像的结果。由 HE 染色图可以看到,选区为正常大肠黏膜腺体,但组织中不同微观结构聚糖的表达含量不同,例如在肠黏膜腺体中无论是上皮细胞或管状腺泡内,两种聚糖均高表达,而结缔组织固有层结构,唾液酸和甘露糖呈现低表达状态。
图 3 肝细胞癌-癌旁组织的显微照片,LCMP2 和 LCMP1 的质谱成像和 HE 染色结果。LCMP2 反映的是唾液酸含量,LCMP1 反映甘露糖的含量。图中的数字代表组织中不同病理结构,1:肝炎区域;2:肝坏死区域;3:肝癌区域。
图 4 结直肠组织的显微照片,LCMP2 和 LCMP1 的质谱成像和 HE 染色结果。LCMP2 反映的是唾液酸含量,LCMP1
反映甘露糖的含量。图中的数字代表组织中不同微观结构,1:肠黏膜上皮组织;2:结缔组织固有层。
上述实验结果均说明结合双功能 LCMPs,利用 iMScope TRIO 质谱成像显微镜可成功实现肿瘤患者组织表面的聚糖分布的可视化成像。成像结果可直观地反映出患者癌症和癌旁组织、同一组织不同病理变化的区域和具有不同微结构的区域中多种聚糖表达水平的变化,显示了肿瘤与聚糖表达含量的相关性,有望在聚糖的空间分布、肿瘤的病理基础以及临床应用等方面提供有利的工具。
3. iMScope TRIO 质谱成像显微镜的测试条件
肝癌-癌旁组织或结直肠癌旁组织分别固定在一片 ITO 导电玻璃上后滴加 LCMPs 溶液,37℃条件下孵育 1 小时。孵育结束后,利用磷酸盐缓冲液(PBS)缓慢清洗组织三次(每次 1mL)后利用去离子水清洗 1 次。待组织干燥后,利用 iMScope TRIO 质谱成像显微镜进行成像实验。质谱条件如下:激光斑点 25μm;步长 30, 30μm;像素 10000 (100, 100);激光强度 32。
致谢:感谢北京大学白玉老师提供本文数据并撰写此文。本文相关内容已正式发表于 Chemical Science. Chem. Sci, 2019, 10, 2320
供稿来源:岛津
来源于:仪器信息网
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