数字PCR是第三代PCR技术,和qPCR技术相比具有灵敏度高、精准度高、对抑制剂耐受性更强等优势,不依赖于标准品和标准曲线,并可直接对起始核酸进行绝对定量,尤其适用于对低丰度样品的检测。目前,数字PCR在医学、制药、环境、食品检测等多个领域展现出了良好的应用前景。
集多重优势于一体的数字PCR实验该如何实施呢?今天呢,我们就一起来看一下数字PCR实验的第一步:模板的制备。
图源:gene-π数字PCR学习网站
模板制备是数字PCR实验成功的关键一步。模板提取、质量控制、避免污染和保存都是模板制备过程中的重要因素。
1、清除环境污染
大多数Taq聚合酶的敏感性都比较高,一旦存在污染可能会发生外源DNA扩增并影响整个实验。而外界环境中存在多种污染源,因此必须遵守严格的实验规程并做好清除污染措施。
为了避免DNA污染,应遵循以下常规PCR建议:
☑ 定期使用3%漂白剂溶液和水/乙醇清洁实验室工作台和设备,或根据应用情况使用DNase/RNase;
☑ 尽可能将管盖好;
☑ 涡旋后进行离心;
☑ 设置无模板对照。
2、模板提取
数字PCR的DNA和RNA模板提取方法与实验室中各种提取方法是兼容的,包括苯酚氯仿法,各种试剂盒提取方法。
☑ 在提取过程中,尽量简化步骤,缩短提取时间;
☑ 减少化学因素对核酸的降解;
☑ 减少物理因素对核酸的降解,如机械剪切力和高温;
☑ 防止核酸的生物降解。
3、质量控制
模板提取之后,我们需要对模板的纯度和质量进行检测,以保证得到最佳的实验效果。例如分光光度法可以验证提取的DNA溶液的良好吸光度(A260/280)的比例。常用的方法还有PicoGreen荧光染料定量检测、琼脂糖凝胶电泳、毛细管凝胶电泳和3':5'分析等,尽量避免污染物和潜在抑制剂的存在。
4、保存
提取的DNA模板的存储也是一个重要的监控因素。保存时需要避免核酸降解,如胞嘧啶脱氨和8-Oxo-2'-脱氧鸟苷的形成,因为氧化损伤可能导致在PCR扩增过程中的碱基转位。缓冲液和温度条件对样品的质量也有影响,一般提取的DNA模板用TE溶解并-20℃保存。
除了上述这些,样本本身固有的其他参数也可能会对数字PCR实验产生影响:
A 、富含GC的模板
因为GC键非常稳定,如果模板包含富含GC的区域可能导致模板不能完全扩增。因此,为了使模板获得更好的变性,可以尝试在PCR混合物中添加DMSO或甜菜碱。
B、高分子量DNA
与qPCR一样,模板的复杂性可能会影响检测性能,例如质粒和长片段基因组DNA。对DNA片段进行限制性酶切可以平衡模板差异,并防止对目标分子的低估。但要保证扩增子序列中不能有酶切位点,对已经片段化的DNA(例如来自福尔马林固定、石蜡包埋组织或细胞游离的DNA)进行酶切可能导致信号丢失。
通常高分子量的DNA或质粒作为模板可能会影响阴阳性微滴分区,建议在进行数字PCR之前使用化学或酶切方法进行DNA剪切,而且剪切步骤可以直接在PCR mix中进行。
C、DNA拷贝数的转换
在数字PCR实验中,需要对模板浓度进行检测,以避免浓度过高造成检测结果饱和(全部都是阳性微滴)。当浓度足够高时,常用的方法如荧光法和分光光度法,可用于定量核酸,从而初步预估使用数字PCR的适合测量浓度。值得注意的是,这种方法测量的是组成核酸碱基单位体积的质量。因此,使用测量质量的方法来确定基因组拷贝数,需要进行相应的换算。当以质量为基础的核酸定量与dPCR结果进行比较时,或从任何用于计算分子拷贝数的方法中得出的结果时,必须包括用于计算基因组分子量的清晰描述,以及用于计算该值的方法。
在数字PCR中,DNA拷贝数的计算只需要知道被研究基因组的质量,然后应用以下公式即可:反应体积中拷贝数=反应体积DNA质量(ng)/研究基因组质量(ng) 。
这里还有在线网站供大家参考:http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html
详情可参考深蓝云公众号的推文:技术小站 | 浓度到拷贝数的换算。
D、逆转录酶
在逆转录酶数字PCR (RT-dPCR)中,RNA转录本需通过一步法或者两步法转化为互补DNA (cDNA)进行使用。在一步法中,逆转录和PCR均在同一分区中按顺序排列。即使每个RNA分子产生多个cDNA拷贝,结果也不会被高估。在两步法中,先进行批量转录,然后对cDNA进行微滴分区,在单独的反应中进行dPCR。逆转录酶的步骤可能是一个主要的错误来源,应在实验设计中考虑。
通过上述的介绍,大家是不是发现数字PCR的模板制备并没有那么复杂呀,感兴趣的小伙伴可以先把模板制备好,然后联系我们,赶紧来体验一下数字PCR的魅力吧。
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来源于:北京深蓝云生物科技有限公司
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