在应对病毒性大流行疾病时,为了有效控制病毒传播和减少感染人群,快速且可靠的诊断是至关重要的。那么目前检测COVID-19的 "黄金标准 "依赖于一种成熟的技术,即反转录定量聚合酶链反应,也叫RT-qPCR。简而言之,这一程序包括RNA提取、逆转录成互补DNA或cDNA,以及用热循环仪对转录本(病毒基因组的特异性)进行实时定量。
为了早期检测和诊断,实时荧光定量PCR仪必须能够检测非常少量的病毒RNA。研究表明,检测限(LOD)或以>95%置信度检测到的最低RNA浓度,表示每1μL可能只有1拷贝的病毒RNA。因此,我们准备用COVID-19 RNA来确定Azure Cielo™的LOD。
材料和方法
Azure Cielo™ 实时荧光定量PCR系统的LOD或分析灵敏度使用FDA批准的COVID-19 genesig® Real-Time PCR assay进行检测,如使用说明书(IFU)所述。使用试剂盒提供的阳性对照模板(PCT)生成6点标准曲线,如下所示:
▲ 表1. PCT系列稀释液
SARS-CoV-2全基因组RNA从欧洲病毒全球档案馆(EvaG)获得,并按照IFU中的描述进行连续稀释,每个稀释液进行20次重复。
结果和讨论
通过表1的PCT稀释液得到标准曲线(图1),将病毒RNA/μL的拷贝数与Cq值关联起来。
▲ 图1. 标准曲线
数据显示,在12.5cp/μL、1.25cp/μL和0.625cp/μL时,Azure Cielo™ 实时荧光定量PCR系统均检测到20/20(100%)的重复,Cq平均值分别是30.49(图2,绿色)、33.66(图2,黄色)和34.80(图2,橙色)。在0.06cp/μL时,检测到12/20(60%)的重复,Cq平均值37.12(图2,红色)。
▲ 图2. 病毒拷贝数与Cq值的关系
结果表明,针对SARS-CoV-2 RNA的检测,Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统的最低检测限LOD为0.625cp/μL,表明Azure Cielo™ 实时荧光定量PCR系统可用于快速可靠地检测COVID-19。
Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统
Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统来自于美国Azure Biosystems公司,配备高品质温度模块,采用光纤和CMOS的检测系统,高能LED的激发,提供高灵敏和可靠的数据。
来源于:北京深蓝云生物科技有限公司
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