新手捋清qPCR原理并不难～

什么是实时荧光定量PCR（qPCR）?

在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过Cq值和标准曲线对起始模板进行定量分析的方法。

一．使DNA产物发出荧光的常用标记方法

① 非特异性荧光染料—SYBR Green

荧光染料也称DNA结合染料，SYBR Green 是一种结合于所有DNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。游离的SYBR Green几乎没有荧光信号，但结合双链DNA后，其荧光信号可呈数百倍的增加。随PCR产物的增加，PCR产物与染料的结合量也增大，其荧光信号强度代表双链DNA分子的数量。

▲ 图1. SYBR Green染料法发光原理

② 特异性荧光探针—TaqMan探针

qPCR中最常用的荧光探针为TaqMan探针，其基本原理是依据目的基因设计合成一个能够与之特异性杂交的探针，该探针的5'端标记荧光基团，3'端标记淬灭基团。完整的探针，两个基团的空间距离很近，淬灭基团的靠近会通过空间上的荧光共振能力转移（FRET）而显著降低由荧光基团发射的荧光。

PCR扩增时，探针一般先于引物结合到目的基因序列上，结合位点位于其中一个引物结合位点的下游。随着引物的延伸通过Taq DNA聚合酶的5'外切酶活性，探针发生水解，荧光基团和淬灭基团进行分离，从而增强了荧光基团的信号。每经过一个PCR循环，就会有更多的荧光基因从探针上脱离，荧光强度会随着PCR产物的增加而增加。因此，根据PCR反应体系中的荧光强度即可得出初始DNA模板的数量。

▲ 图2. TaqMan探针法发光原理

二．荧光定量PCR系统如何记录荧光信号

所有的实时荧光定量PCR系统都有三个共同的组成部分：温控系统，光源系统和检测系统。温控系统用于PCR扩增，执行高温变性，低温退火和中温延伸的步骤；光源系统用于激发荧光染料或荧光基团，使其发出信号；检测系统采集荧光信号。温控系统每完成一个循环，光源和检测系统则先后进行激发和采集，从而实时记录每一个循环荧光信号的变化。随着PCR反应的进行，产物逐渐积累，荧光信号逐渐增强。

▲ 图3. 实时荧光定量PCR系统检测原理

那么Azure Cielo™ 实时荧光定量PCR系统，采用了高能LED作为光源系统，可保证光源强度高，光源一致性好；高品质的帕尔贴温度模块作为温控系统，升降温速率快，可设置12列跨度30°C的温度梯度；卓越的CMOS拍照+光纤信号传输作为检测系统，CMOS检测灵敏度高，光纤传输速度快，无光损失和噪音干扰，无需ROX校准。

Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统的高配置保证为您的科学研究提供高精准度、高灵敏度和高可靠性的实验结果。

▲ 图4. Azure Cielo™ 实时荧光定量PCR系统

三．如何根据荧光信号得出初始模板量

实时荧光定量PCR系统所监测到的所有循环的荧光信号可以绘制成一条曲线，即为荧光扩增曲线。扩增曲线一般分为基线期、指数期、线性期和平台期。指数期内，每个循环PCR产物量大约增加1倍（假定100%反应效率），该阶段的扩增反应具有高度特异性和精确度，所以重复性好。

▲ 图5. 扩增曲线

qPCR软件会在指数期划定一个阈值线，阈值线对应一个荧光强度值，即阈值。在qPCR过程中，各扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时，所经过的扩增循环数即是Cq值。Cq值与初始模板量的对数成线性关系。样本初始模板量越多，荧光信号达到阈值所经历的循环数越少，即Cq值越小。

▲ 图6. Cq值与初始模板量的关系