我们都知道在实时定量PCR(qPCR)中,可以通过Cq值和标准曲线得出样本的初始拷贝数。但Cq值与样品中靶标的拷贝数有关,也会受到PCR反应的效率和仪器检测灵敏度的影响。高灵敏度的仪器可以减少检测样品所需的循环数,节省时间并提高效率;同时也可以减少假阴性的存在。Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统的设计初衷,就是为了高灵敏高性能而生,每个孔配有单独的激发和发射光纤,可有效提高灵敏度并降低背景噪声干扰(图1左)。此外跟同类产品相比,Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统使用全孔检测技术,每个孔可采集约100,000个数据点,使每个qPCR扩增曲线能够准确、可重复和灵敏地表示荧光强度,从而提高荧光数据的可靠性(图1右)。
▲ 图1. 高性能光路系统
为了进一步表明Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统的灵敏度,与同类产品进行了以下比较实验:使用酵母的三个RNA靶标进行检测,分别是高丰度的Actin基因、低丰度的6Y’端粒基因,以及单拷贝的TEL06R端粒基因。
材料和方法
从10mL酵母培养液中制备出RNA,将3µg RNA逆转录成cDNA作为模板备用。对于Actin,在Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统上使用的cDNA按1:20稀释;其他的cDNA均按1:10进行稀释。引物如下:
▲ 表1. Actin、6Y’端粒基因和TEL06R端粒基因的引物对
采用4个4倍系列稀释的cDNA模板和一个无模板对照来计算qPCR扩增效率,反应体系和扩增程序如下:
结果和讨论
在高丰度Actin和低丰度6Y’端粒基因的检测中,Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统和同类产品的扩增效率非常相似(表2)。然而,在单拷贝TEL06R端粒基因的检测中,发现同类产品得到的Cq值偏大,位于35-38之间,导致计算出的扩增效率大于200%,不能作为参考数据;Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统则计算得出E=96%(表2)。
▲ 表2. 各基因的扩增效率及R2值
同时结果表明,尽管Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统的Actin cDNA上样量仅为同类产品的一半,但Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统的Cq值小于同类产品的Cq值,两者相差0.65(表3)。针对低丰度的6Y’端粒基因和单拷贝的TEL06R端粒基因,两者的Cq值差异较大,差值分别是2.25和4.02(表3)。这些结果表明,随着基因起始拷贝数的减少,Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统灵敏度的提高变得尤为重要。
▲ 表3. 各基因的数据对比
灵敏度也会直接影响数据的准确度和再现性。随着PCR循环数的增加,非特异性产物或引物二聚体扩增的可能性也增加。尤其是使用非特异性荧光染料(如SYBR green)检测PCR产物时,更需要避免过多的循环数。因此,在早期循环中检测扩增的能力大大提高了数据的可靠性。
具有单孔检测的Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统设计用于最小化背景噪声和最大化灵敏度,以实现qPCR反应中最高的特异性和精确度。快快申请试用,让它帮助你优化qPCR实验吧。
来源于:北京深蓝云生物科技有限公司
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