一文知晓CRISPER基因编辑早期脱靶克隆快速筛选的多重naica®数字PCR方法

使用序列特异性的CAS内切酶进行精确性敲除，敲入，替换等已成为一种常用的分子生物学手段。但是，为了识别所需的基因修饰，排除脱靶克隆，仍然需要筛选几百个单克隆细胞系。而大量克隆的维护和筛选是一个费力、耗时、容易出错的过程。

欧洲分子生物学实验室（EMBL）研究人员Moritz Kueblbeck, Andrea Callegari等分享了一种快速验证基因编辑效果的实验方案。该方案使用naica^®微滴芯片数字PCR系统（Crystal Digital PCR™）实现了一次三色分析就可完成目标拷贝数的评估和脱靶事件的检测。且基于数字PCR (dPCR)的高敏感性，无需大量的样品，因此，在早期就可以完成筛选试验。Crystal Digital PCR™一次实验3个小时内就可完成，对于编辑错误的克隆当天就可终止培养。那么这个实验具体是怎么设计的？就让我们一起来看看吧。

应用亮点：

▶ naica^®微滴芯片数字PCR系统一次三色分析同时完成目标拷贝数的评估和脱靶事件的检测，是非常强大的绝对定量工具。

▶ naica^®微滴芯片数字PCR系统对长插入片段(如mEGFP)拷贝数提供稳健的检测方法。

▶ naica^®微滴芯片数字PCR系统只需少量生物样本，可以在早期完成检测，快速完成CRISPR筛选，节省时间。

Single-step 3-color Crystal Digital PCR™实验设计：

该实验共设计了三个探针：

1.“total tag”（HEX基团标记）检测mEGFP转基因；

2.“on-target tag”（FAM基团标记）检测内源NUP93编辑位点的最后一个外显子与整合的mEGFP转基因(标签)的5'序列之间的连接；

3.reference(CY5基团标记)作为内参，对“total tag”和“on-target tag”进行归一化。“total tag”归一化获得整合的mEGFP拷贝数和“on-target tag”获得靶标上整合的mEGFP拷贝数。

实验使用U-2 OS细胞作为基因编辑对象，其具有3个NUP93等位基因。

结果分析：

如图B所示，对多个U-2 OS细胞系的基因编辑效果进行分析，naica^®微滴芯片式数字PCR系统结果显示克隆35，52和247的U-2 OS细胞mEGFP总拷贝数和靶标拷贝数都为3，这表明这三个细胞系的所有3个NUP93等位基因都成功编辑，没有脱靶，这个结果与检测金标准的Southern blot的结果一致（图C），而克隆5虽然mEGFP总拷贝数和靶标拷贝数一致，但与NUP93位点的预期数量不匹配。这表明其可能发生基因组的重排，而Southern blot结果也验证了这一现象，其出现了一个小于正常NUP93的拷贝条带。对于克隆25和246，虽然其靶标拷贝数符合预期，但是其总拷贝数大于3，这表明其可能存在脱靶整合或者不完全HDR（homology-directed repair）现象，而Southern blot结果显示其存在一个过大的整合条带，表示其可能存在基因重排。

上述这些结果表明基于naica^®微滴芯片式数字PCR系统（3-color Crystal Digital PCR™）的基因编辑脱靶检测的三色数字PCR检测方法，是一种快速简便的一步检测方法，其结果与耗时更长的Southern blot技术完全一致，可以用来快速评估基因编辑效果，筛选适合的基因编辑细胞株系。