导读:杨朝勇课题组近期在Angew. Chem. Int. Ed.期刊上发表了文章,提出了一种基于表面增强拉曼散射(SERS)借力策略的Au@Pt核壳结构纳米探针,可以同时检测和区分多种不同ROS。
杨朝勇课题组近期在Angew. Chem. Int. Ed.期刊上发表了题为“Direct and Simultaneous Identification of Multiple Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Living Cells Using a SERS Borrowing Strategy”的文章。该工作提出了一种基于表面增强拉曼散射(SERS)借力策略的Au@Pt核壳结构纳米探针,能够吸附多种活性氧物种(ROS),获取其拉曼指纹图谱,从而同时检测和区分多种不同ROS。通过表面修饰三苯基膦(TPP)分子,Au@Pt-TPP纳米探针能够靶向线粒体,实现单个活细胞内线粒体中多种不同ROS的原位动态监测。
背景介绍
活性氧物种(ROS)是一类具有强反应活性的含氧物质(包括•O2–,H2O2,•OH和1O2等)。细胞线粒体中ROS的过度产生或紊乱会破坏细胞氧化还原平衡,引起细胞氧化应激,影响正常的生理过程,甚至导致多种疾病,包括癌症、炎症、心血管疾病和神经退行性疾病等。为了深入理解多种ROS在生物学过程中扮演的角色和发挥的作用,需要发展能够同时检测并准确区分多种ROS的方法。但是,目前活细胞水平检测ROS的方法,包括荧光法、电化学法和拉曼光谱法等,都难以满足上述要求。荧光探针大都只能对单独某一种ROS进行检测,且探针的设计和合成十分复杂,也存在探针容易被光漂白和生物相容性差等缺点;电化学法的电极插入对活细胞有一定的伤害和影响,而且电极在亚细胞水平的定位精度不足;拉曼光谱法通过化学反应间接检测ROS,且很难实现对多种不同ROS的同时检测和区分。因此,发展能够同时检测和区分活细胞中多种不同ROS并原位监测ROS动态变化的方法是一项重大的挑战,也是亟待解决的重要问题。
设计思路
为了解决上述问题,杨朝勇课题组提出了一种基于SERS借力策略的Au@Pt核壳结构纳米探针。壳层金属Pt能够吸附多种ROS,并借助具有极高SERS活性的内核Au纳米粒子的电磁场长程效应,提升壳层金属SERS的增强性能。Au@Pt纳米探针可以直接获取多种不同ROS的拉曼指纹图谱,对物种进行指认。不同的ROS的分子振动模式不同,相应的拉曼信号峰的位置也不同,因此可以实现多种不同ROS的同时检测和准确区分。当Au@Pt表面修饰TPP分子后,Au@Pt-TPP纳米探针能够靶向细胞线粒体,并在显微拉曼光谱仪的辅助下,原位监测单个活细胞内线粒体中不同ROS的动态变化。
图1 基于SERS借力策略原位监测单个活细胞内线粒体ROS
数据介绍
首先通过原位还原的方法在直径55纳米的Au纳米粒子表面沉积了Pt单质,我们制备了壳层厚度可控的Au@Pt核壳结构纳米探针。通过透射电镜和元素成像表征,证明了Au纳米粒子表面Pt壳层的成功制备(图2a)。另外,紫外可见吸收光谱表征也表明,在Au纳米粒子表面沉积Pt后,其最大吸收峰的位置发生红移,且随着壳层厚度增加而增大(图2b)。如图2c所示,得到的Au@Pt纳米探针能够通过拉曼指纹图谱检测到溶液中低至生理浓度(0.1 mM)的H2O2在波数为833 cm-1处的信号峰,而Au纳米粒子则检测不到。这说明Au虽然具有很强的SERS活性但对于ROS的吸附能力较弱,也证明了SERS借力策略的有效性。
图2 Au@Pt纳米探针的结构和性能表征
接着,从人乳腺癌MCF-7细胞中提取线粒体,用Au@Pt纳米探针检测线粒体呼吸产生的ROS。如图3a所示,Au@Pt纳米探针通过不同的ROS(即•OOH,H2O2, •OH)的拉曼指纹图谱(即675 cm-1和733 cm-1,830 cm-1,973 cm-1),同时检测和区分线粒体呼吸产生的三种不同的ROS。由于这三种ROS中都含有H元素,所以当细胞培养基被替换成重水配制的培养基后,ROS中的H元素被替换成D元素,这些检测到的ROS的拉曼振动峰都向低波数发生了移动,与经典的分子键谐波振荡模型相符合(图3b)。我们也通过密度泛函理论(DFT)计算模拟了不同ROS在Pt团簇表面最稳定的吸附构象,并得到了相应的振动波数值(图3c)。这些模拟结果与实验结果相一致,进一步证实了Au@Pt纳米探针同时检测和区分不同ROS的能力。
图3 重水实验和DFT理论计算验证纳米探针检测ROS的能力
最后,在Au@Pt纳米探针表面通过Pt-S键修饰了HS-PEG-NH2(分子量2000 Da),并进一步通过EDC/NHS交联反应修饰上具有线粒体靶向功能的TPP分子,将Au@Pt-TPP纳米探针靶向到细胞中的线粒体。如图4a和4b所示,在与MCF-7细胞孵育24小时后,Au@Pt-TPP纳米探针内吞进细胞并成功靶向线粒体,而Au@Pt则无法靶向线粒体,证明了TPP修饰的有效性。如图4c所示,当Au@Pt-TPP纳米探针作用于MCF-7细胞,能够在单细胞水平原位监测受到佛波酯PMA刺激后的30分钟内,随着作用时间的延长,细胞逐步发生氧化应激以及线粒体产生大量ROS的过程。我们还考察了PMA和抗氧化剂二甲基硫脲(•OH清除剂)同时处理的条件下,线粒体ROS的动态变化。如图4d所示,在二甲基硫脲存在情况下,只能检测到•OOH和H2O2的信号而没有•OH的信号,说明二甲基硫脲选择性清除了•OH。这些结果表明,Au@Pt-TPP纳米探针能够成功实现单个活细胞内线粒体ROS动态变化的原位监测。
总结
该工作设计了一种基于SERS借力策略的Au@Pt纳米探针,Pt壳层能够吸附多种ROS,并借助内核Au的SERS活性,获取多种ROS的拉曼指纹图谱,同时检测和区分多种不同ROS。在Au@Pt表面修饰TPP后,Au@Pt-TPP纳米探针能够靶向细胞线粒体,实现外界刺激条件下单个活细胞内线粒体中多种不同ROS的同时原位监测。未来可将Au@Pt纳米探针应用于监测正常生理过程、细胞应激反应和疾病发生发展进程中细胞中ROS的动态变化和揭示不同ROS的作用机制。
来源于:杨朝勇课题组
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