干货分享|分子诊断之DNA测序漫谈

近期主题我们梳理了分子诊断技术中测序部分，测序技术根据样本类型不同包含：DNA测序、RNA测序、单细胞测序、甲基化测序等。今天我们讨论DNA测序。

图1 基因组、转录组、蛋白质组和代谢组（脂质组）关系示意图

DNA测序类型包含：全基因组de novo测序（从头测序）和重测序；重测序包含：全基因组测序（WGS）、全外显子测序（WES）、靶向测序。

全基因组de novo测序

全基因组de novo测序又称从头测序，指不需要任何基因序列信息即可对某物种进行测序，最后通过生物信息学的分析方法对测得的序列进行拼接、组装，从而获得该物种完整基因组图谱的方法。

从头测序的方法可用于测定基因组序列未知或没有近缘物种基因组信息的某物种，绘制出基因组图谱，从而达到破译物种遗传信息的目的。对于任何生物体，只有进行过从头测序后，才可能进行详细的基因分析。[1]

重测序

重测序（re-sequencing）又称重新测序，指对已有参考基因组物种的不同个体进行的基因组测序，并在此基础上对个体或群体进行差异性分析的方法。重测序包含：全基因组测序（WGS）、全外显子测序（WES）、靶向测序。

重测序方法主要用于辅助研究者发现单核苷酸多态性位点(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)、插入和缺失（Indels）、拷贝数变异（Copy number variation,CNV）等变异信息，从而获得生物群体的遗传特征。

全基因组测序（WGS）

全基因组测序 （Whole Genome Sequecing，WGS）：是指对某种生物基因组中的全部基因进行测序，即把细胞内完整的基因组序列从第一个DNA分子开始直到最后一个完完整整地检测出来，并按顺序排列好。

图2 WGS测序示意图

全基因组测序覆盖面广，能检测个体基因组中的全部遗传信息，并且准确性高。使用NGS技术分析全基因组可提供所有基因组改变的碱基序列图谱，包括：单核苷酸变异（SNV）、插入和缺失（Indels）、拷贝数变异（CNV）及结构变异（SV）等。目前可应用于人类、动植物及微生物，尤其可应用于鉴定遗传疾病、查找驱使肿瘤发展的突变及追踪疾病的暴发等发面。[1]

2020年，全基因组泛癌联盟项目（PCWAG）针对38种不同癌症2,600例患者的WGS数据进行分析并同时发表了21篇Nature系列文章。该研究提供了目前较全面的原位癌基因组信息，利用这些基因组信息和WGS技术可检测95%的肿瘤样本中至少有一种突变，检测全面性远高于WES和大Panel测序技术。基于上述数据，肿瘤基因组学在非编码区和染色体结构上的变异研究又取得了巨大进展，对后期WGS在临床上的应用也有巨大推动作用。［3］

图3 WGS检测突变示意图［4］

全外显子组测序（WES）

虽然WGS测序能提供基因组的完整序列组成，但复杂的数据分析和高昂的成本，使得全外显子组测序技术得以发展。全外显子组测序 （Whole Exome Sequecing，WES）：是指对某种生物基因组中的编码区域进行测序。

真核生物基因的全部外显子，称为“外显子组”，外显子组一般包含22,000个基因，仅占人类基因组的1-2%，但却包含了85%的致病突变，研究人员利用WES发现了与广泛疾病相关的功能变异基因，并根据这些基因进行这些疾病的诊断以及辅助治疗方案的制定。相较于WGS，WES大大缩短检测周期、节约成本，因此可在一定程度上替代WGS。[5]

图4 WES测序示意图[2]

靶向测序（TS）

靶向测序（Target region sequencing,TS），也称目标区域测序，指利用多重PCR或捕获方法扩增目标基因组区域并测序，可以获得指定目标区域的变异信息。

靶向测序主要有两种形式：基于扩增子建库测序或基于杂交捕获法建库测序。与杂交捕获法建库测序相比，扩增子建库测序所需起始样本少，建库流程少，大大缩短了整体检测时间且对低质量样本的检测也非常有利。

与WGS、WES相比，TS测序能够获得更深的覆盖度和更高的数据准确性，提高了对目标区域的检测效率。如福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)和循环肿瘤DNA(ctDNA)，其中DNA质量和/或肿瘤含量较低，更深的覆盖范围使TS能够识别出只存在于一小部分恶性细胞（即亚克隆）中的突变，并且在检测微小残留疾病的情况下，变异等位基因频率(VAF)低至0.1-0.2%。[6-8]

图5 TS测序示意图[2]

但常规多重PCR法建库技术一系列操作需要分多个步骤进行，在每一次开盖操作过程中都有引入污染物的风险，因此，2017年泛生子在多重PCR法建库技术原理基础上发明出专利技术——“一步法”扩增建库技术（中国发明专利ZL201710218529.4）（以下简称“一步法”）。

“一步法”技术通过优化PCR温度和引物浓度，将常规PCR法建库的多个步骤进行浓缩，即在单管、单次PCR反应中就可以实现目标区域的扩增和接头连接的目的，样本全流程无损的同时进一步减少了污染的可能性，操作流程便捷的同时也大幅缩短了建库时间。

图6 常规多重PCR法VS“一步法”建库操作流程对比

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