导读:本篇工作结合超高效液相、天然质谱、串联质谱技术,发展了一种功能代谢组学的分析技术,并将其应用于蓝藻生物膜中糜蛋白酶抑制剂的筛选,发现了rivulariapeptolide这类新颖的nM水平蛋白酶抑制剂
大家好,本周向大家分享Nature Communications上的一篇文章,题目为Native metabolomics identifies therivulariapeptolidefamily of protease inhibitors,文章共两位通讯作者,分别为加州大学圣地亚哥分校的William H.Gerwick教授与德国图宾根大学的DanielPetras博士,两课题组分别研究海洋天然产物与功能代谢组学。
天然产物指各种生命体中化学结构丰富、生物活性多样的特殊代谢物,在药物发现中发挥了十分重要的作用。目前,传统的正向、反向化学遗传学,均依赖于纯化的代谢物小分子进行生物活性的研究,使得系统发现药物活性小分子面临着周期长、工作量大等一系列不足。本篇工作结合超高效液相(UHPLC)、天然质谱(native MS)、串联质谱(tandem MS),发展了一种功能代谢组学的分析技术,在推进新颖天然产物的反向化学遗传学研究上具有重要意义。
首先对该技术的实验流程进行简要介绍。在获得天然产物的甲醇粗提物后,对其进行RP-UHPLC分离。考虑到色谱分离一般使用酸性条件,且使用乙腈作为流动相,与native MS并不兼容,作者在柱后引入辅助泵,通过醋酸铵水溶液将pH值调节到类似天然的条件。最终,使用第二个辅助泵向体系中注入目标蛋白,并通过质谱测量产生的蛋白质-代谢物复合物。考虑到潜在的非特异性相互作用,作者选择全离子碎裂模式(all-ion fragmentation),并设置碰撞能量阈值为20 %。此外,作者还进行了不注入蛋白的实验组,作为参照的代谢组学分析结果。
在本文中,研究人员选择的模式目标蛋白为糜蛋白酶(chymotrypsin),模式代谢粗提物来自蓝藻,以筛选新颖的蛋白酶抑制剂。在建立上述方法的过程中,研究人员优化了native MS的pH与乙酸铵浓度,并使用已知糜蛋白酶抑制剂molassamide,揭示该方法检测蛋白-代谢物相互作用的检测限约为0.1-1µg/mL,并证实在含有40 %有机溶剂的场景下研究上述相互作用的可行性。
接下来,研究人员对所获得的数据进行分析。相比于未结合糜蛋白酶,代谢物-糜蛋白酶复合物会产生一定的m/z迁移,其质量对应于与该蛋白质结合的小分子。同时,复合物相对于未结合糜蛋白酶的质谱峰强度比一定程度上揭示了在实验条件下的特定代谢物结合的亲和力。基于天然质谱中复合物出现的洗脱时间以及代谢物的分子质量,研究人员进一步从不含糜蛋白酶的代谢组学结果中寻找对应的代谢物小分子串联质谱图,并利用化学信息学手段初步分析代谢物的分子结构。
随后,基于上述信息,研究人员对目标小分子进行针对性纯化,利用多种NMR技术实现精确的结构鉴定,并将获得的这类新颖结构的小分子命名为rivulariapeptolide,于体外证实上述分子对糜蛋白酶活性的抑制。
综上,本篇工作结合超高效液相、天然质谱、串联质谱技术,发展了一种功能代谢组学的分析技术,并将其应用于蓝藻生物膜中糜蛋白酶抑制剂的筛选,发现了rivulariapeptolide这类新颖的nM水平蛋白酶抑制剂。
原文地址:https://www.nature.com/articles/s41467-022-32016-6
来源于:王初课题组公众号
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