细胞生物学研究的利器——仪器平台负责人经验谈

细胞是生命的最小单位，细胞生物学是生命科学研究的重要领域。有专家说，“了解了细胞，我们就能了解生命”。细胞生物学是研究生命活动的一个重要前沿学科方向，这一学科分支众多，主要关注细胞形态结构、细胞生命活动功能、细胞遗传调控以及细胞与其生命活动环境当中的各种关系，而这一系列的研究离不开科学仪器的帮助。仪器信息网特别向中国科学院分子细胞科学卓越创新中心细胞分析技术平台约稿，以下内容为中科院分子细胞科学卓越创新中心科技条件处处长张文娟和中科院分子细胞科学卓越创新中心细胞分析技术平台主任边玮联合撰写，两位老师根据多年从业经验，详细介绍了8种在细胞生物学研究中应用到的“利器”。以下为供稿内容：

荧光显微成像技术和流式细胞分析/分选技术是生命科学研究尤其是细胞生物学研究中应用最广泛、最频繁、需求量最大的实验技术手段。在中国科学院分子细胞科学卓越创新中心细胞分析技术平台18年的建设历程中，结合细胞生物学学科发展过程中不断提升的实验需求，平台经历了多次技术迭代、仪器功能升级、应用场景拓展和设备研发深入探索，已建立成为一个以荧光显微成像、流式细胞检测及分选和电子显微成像3个专业技术部门为核心，以严谨细致的科研服务为宗旨，以科研技术应用及创新为目标的细胞生物学研究技术装备体系。从荧光显微镜到超高分辨率荧光显微成像技术，从2激光4色流式细胞检测到光谱流式细胞分析技术，一路行来积累了一些经验，现将点滴体会分享如下。

一、以荧光显微成像技术为代表的多种光学成像手段

细胞生物学科研实验可以运用细胞和组织的显微成像技术，通过从几十纳米超高分辨率到厘米级大尺度的3D成像，获取生物大分子的时间及空间信息。荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、活细胞工作站、超高分辨率显微镜、双光子显微镜、光片显微镜等是大型显微成像平台技术建立中不可缺少的仪器类型。

1. 荧光显微镜

荧光显微镜是研究中使用的最基础的成像实验工具，科研级荧光显微镜常规配有UV、BLUE、GREEN激发的荧光滤色块组，可以加配适合CFP、YFP及CY5等观察和成像的荧光滤色块组，结合制冷型彩色CCD或CMOS、软件及高性能计算机，实现明场和荧光显微成像获取显微图像和动态视频图像。图像采集分析软件能够对图像进行分析测量及后期图像处理。正置荧光显微镜可以配有微分干涉组件，匹配不同物镜4x、10x、20x、40x、60x调节组件可以获取样品形貌图像以及偏振光图像。倒置荧光显微镜通常配有相差组件，同时匹配长焦相差物镜，获取样品相差形貌图像。

荧光光源有全光谱白光LED灯（寿命≥25000小时）、长寿命金属卤素灯荧光光源（寿命≥2500小时）、氙灯（寿命约1200小时）、高压汞灯等。由于传统高压汞灯使用额定寿命低（200小时），更换汞灯需要调光路，灯泡在使用过程中光效降低明显，灯熄灭后要等待冷却才能重新启动，点燃灯泡后不能立即关闭，一般需要等15min，且压力很高，紫外线强烈，使用中存在安全隐患，已逐步被取代。LED灯有诸多优点，如光效率高、发热少、寿命长、稳定性高、可调节光强、即开即用，由光纤导入显微镜，更换灯泡时无需调整光路，是荧光显微镜首选最优质的荧光光源。目前市场上荧光显微镜明场光源已由高亮度LED灯代替卤素灯，使用寿命超过20000小时，光强度可通过旋钮调节，也可配合灰度滤光片调节。

显微镜公司会根据用户的实验需求、应用方向和预算，设计相应的配置技术方案，提供优质的售前售后服务。

2. 激光共聚焦显微镜

激光共聚焦显微镜是基于点扫描共聚焦成像原理，实现多通道荧光成像、Z-stack成像、time-lapse成像、多点成像、拼图成像等，有ZOOM成像、ROI成像、光谱扫描、多维扫描（xyz、xyt、xyzt、xy扫描）等多种成像模式。激光共聚焦显微镜主要由全自动荧光显微镜、激光光源、扫描装置、检测系统及专用软件和图像工作站组成。显微镜配备10x、20x、40x、63x等高数值孔径共聚焦专用物镜和高精度全电动载物台，精准控制步进精度；多功能同步控制软件和图像工作站可以在获图过程中实时调节参数，也可以对图像进行后期的重构和分析；搭配特定的硬件和软件模块，还可以进行FRET、FRAP、FLIM、FCS等功能成像和分析。

常用的固体激光器波长有405nm、458nm、488nm、514nm、561nm、638nm，也可根据实验需求配置592nm、660nm、775nm等更多波长激光器，功率约30-100nw。气体激光器有多谱线Ar离子激光器（发射波长458nm、476nm、488nm、496nm、514nm），氦氖543nm激光器和氦氖633nm激光器，由于使用寿命较短、损耗快，已逐步被固体激光器取代。新一代连续光谱白光激光器能够在440-790nm步进1nm任一波长最佳激发样品荧光，最大程度提高激发效率，更适合于实验中新型染料应用。

检测系统一般有3-4个荧光通道和1个透射光通道，可实现多通道荧光成像和明场成像，通过光栅或棱镜分光可进行光谱扫描成像。探测器为光电倍增管PMT，超高灵敏度GaAsP检测器更有利于捕捉微弱荧光信号从而获得更好信噪比的高质量荧光图像。近年来基于Confocal平台搭配超高分辨模块（如Lighting技术、Airyscan 2技术等）实现了超高分辨率显微成像，成像分辨率可达到XY120nm，Z轴200nm。优化的高分辨扫描技术、共振扫描技术等提高了扫描成像速度，可在更短的采集时间内以更大视野和超高分辨率实现低光毒性高质量成像

3. 活细胞成像

宽场活细胞成像设备是借助高精度的Z轴防漂装置、CO2气体及温控装置、灌流装置、专用物镜和高分辨率制冷型CCD或SCMOS等元件，进行长时程活细胞形态及荧光标记信号的追踪。转盘共聚焦显微成像系统运用双转盘技术，极大的减少了对样品的光漂白和光毒性，采集荧光信号选用科研级sCMOS/EMCCD相机具有高光电转换量子效率和低读出噪音优势，加上超级复消色差物镜、超高分辨率模块（如Sora、SR）结合deconvolution 专业的图像软件和高性能图像工作站分析处理，获得具有高信噪比、高时空分辨率的动态图像。

4. 超高分辨率荧光显微成像

多种光学原理实现的超高分辨率荧光显微成像STED、SIM、STOM、TIRF等技术已经在生命科学研究中应用，由Stefan W. Hell团队推出的easy STED、easy 3D STED、自适应照明技术以及新型超高分辨率专用荧光染料的应用，免去了复杂手动校准光路过程，降低了光漂白和光毒性，提高了仪器的实用性和稳定性，获得更高分辨率和成像深度，是超高分辨率活细胞成像和3D成像的高端技术设备。国内已有多个研究团队推出超高分辨率显微成像仪器，Sparse-SIM实现了活细胞光学成像空间分辨率60nm的突破，集GI-SIM/ TIRF-SIM/3D-SIM/nonlinear SIM的多模态结构光超分辨成像系统实现了更快的成像速度、更长的成像时程和更高的图像分辨率，能够满足生物学研究中大多数荧光成像实验的需求。超高分辨率荧光显微成像成为可视化活细胞分子动态变化的新技术，使细胞生物学研究进入了新时代，其技术的发展和应用将对生命科学研究产生重大影响。

5. 光片显微成像

实验动物大尺度组织3D荧光显微成像一直是困扰生物研究的技术难题，运用双光子显微成像技术可以在活体动物组织上实现超过300µm的成像深度。光片显微成像技术由于采用片层激发和面成像技术，减少了光漂白和光毒性，大大提高了成像速度和图像的信噪比，结合组织透明化技术的研发和应用，实现了几厘米的组织3D荧光显微成像。针对不同实验动物组织的各种基于水溶性、有机溶剂、水凝胶等的透明化方法经过不断应用探索，科研人员在平台技术支撑下成功获取了实验鼠脑组织、肝脏、肾脏、心脏、肺、肌肉、胰腺、乳腺、脂肪、睾丸、类器官甚至骨组织等的3D图像。对于实验动物胚胎、小型实验动物（线虫、果蝇、斑马鱼等）的活体发育过程也能够运用光片显微成像技术进行3D动态捕获。

光片显微成像图像结果的输出和重构处理分析是实验中面临的瓶颈，改进数据存储、输出和图像处理技术势在必行，同时新的理论技术的发展、相关硬件技术的改进以及制样方法的开发都将促进光片荧光显微技术的应用。目前有多个商品化国际品牌设备，国内研发团队的产品日渐成熟，且已经在DEMO过程中深受用户的认可和依赖，尤其在透明化样品制备技术及图像数据的输出和处理等瓶颈技术方面都有深受关注和切实的优化，使得光片显微成像整体实验流程更加顺畅。

6. 组织切片高通量成像和光谱成像

组织切片高通量成像设备可完成100-200片组织切片全自动明场、偏光和多通道荧光显微成像，兼容26x76mm、52x76mm、102x76mm多尺寸玻片数字化扫描成像，在图像采集程序设置、自动对焦、采集速度、灵敏度、大视野成像及拼接、成像模式快速切换等技术要素上有很优异的特色，专业软件可批量分析处理图像数据同时兼容第三方数据分析软件，是组织切片形态学、病理学研究和蛋白质功能研究的有利工具。最新推出的组织切片多光谱荧光标记技术和光谱成像技术满足了光谱范围更广的荧光标记和显微成像实验需求，光谱成像范围达到440 nm –780nm，实现100个以上标志物自动化、超多重生物标志物检测和高速显微成像。借助专业的图像分析软件进行后续图像的光谱拆分、定量分析和更多个性化分析。

二、流式细胞分析/分选技术

1. 流式细胞分析

流式细胞分析技术能够对细胞群、细胞亚群乃至单个细胞进行多参数、快速的定性/定量分析，分析速度可达每秒上万个细胞。流式细胞分析仪主要由液流系统、光学系统和电子系统构成，相较于荧光显微成像设备，仪器运行时在系统稳定性和操作复杂性等方面都对使用者的技术掌握程度和操作能力有较高的要求。流式细胞分析仪配备多种波长激光器，通常有355nm、405nm、488nm、561nm、640nm及其它波长激光器，根据实验需求配置检测通道的滤光片组。流式细胞分析多采用单管上样模式，也可借助孔板上样装置实现96和384孔板高通量上样和数据读取功能。声波聚焦技术将待测细胞精确聚焦在样本流的中心位置，最大限度避免细胞堵塞，从而实现在提高样本通量的同时，保证读取样品速度及获取的数据质量和精度。

多色荧光分析是流式细胞分析技术发展的必然趋势，目前传统滤片式流式细胞分析仪已经能够选择26种不同波长激光器，且可同时安装9个激光器，支持多达50个高性能检测器，提高灵敏度并降低了噪声，从硬件水平上支持48色荧光标记细胞样品的采集和分析。而光谱型流式细胞技术的诞生，为多色荧光分析打开了全新的技术之门，目前商品化设备可以配置7个波长激光器和188个检测器，覆盖360nm – 920nm光谱范围，能够提供更为精确和全面的荧光信号信息，可从混合细胞群体中检测微弱信号和稀有细胞群体，同时自发荧光探测功能、光谱数据库信息以及光谱数据解析算法都可以为科研人员获得更高保真度的数据和更精准的分析解读提供便利，同时也使得科研人员意识到随之而来的多色流式细胞样品制备技术的挑战。

质谱流式技术独辟蹊径地将质谱技术和流式分析技术相结合，采用金属标记抗体避开了荧光串色和自发荧光的困扰问题，检测通道数量可达上百个。但金属标记抗体高昂的实验成本一直是限制其广泛应用的制约因素。除大家熟悉的Fluidigm公司等国外厂商外，近年来国内已有至少两家本土化公司推出国产同类设备并配备专业团队进行抗体标记技术研发，国内外已有多个团队和商业公司针对质谱流式技术进行进一步的开发，有望提高检测速度，降低实验成本。

2．流式细胞分选

流式细胞分选实验面对的是分选后细胞活性、目标细胞得率、样品是否污染等诸多情况，与仪器的校准情况、液流稳定性、喷嘴孔径、细胞浓度、细胞状态、目的细胞比例、标记荧光强度、分选速度、分选时长等因素甚至环境情况密切相关。仪器使用者需要在仪器调试、清洗维护等方面投入大量精力和时间以保障细胞分选实验的顺利进行。在大型流式细胞技术平台，为保障多用户、多研究方向的流式细胞分选实验需求，流式细胞分选仪器通常会配置4-7个激光器，实现二路、四路甚至六路分选和孔板分选。全光谱超高速流式细胞分选仪配置高达9个激光器和60个检测器，既可以选择传统补偿模式进行数据分析，也可以切换成全光谱分析模式，以进行更精细的细胞亚群鉴定。

由于流式细胞检测和分选实验样品是单细胞悬液，样品的浓度、特性、目标细胞比例、多色荧光试剂的设计等等因素都构成了流式细胞样品的复杂性和实验的不确定性，因此充分做好实验前的准备工作，保证较好的待测样品质量、充足的试剂耗材储备、良好的仪器状态、技术人员高超的技能等都将促进实验取得高质量结果。

三、结语

生命科学前沿研究的实验需求与高端仪器技术发展相互依赖、相互促进、相辅相成。激光显微切割技术、单细胞捕获技术、大颗粒样品分选技术，以及成像流式技术、成像质谱流式技术、在体流式细胞技术、光电关联成像技术等跨类别的技术融合，专业图像分析和处理软件的功能开发，为科研人员带来更优质实验结果、更多实验需求想象空间的同时，技术和仪器设备本身也将在应用中不断创新、完善和突破。

近年来随着国家在大型科研仪器和关键部件研制领域项目的大力支持和投入，国内大型仪器技术快速发展，如超高分辨率荧光显微成像系统、光片显微成像系统、超快三维荧光成像系统、拉曼单细胞分选仪、质谱流式细胞分析仪等等国产高端仪器都信心满满地走进科研单位，出色的承担前沿科研实验，性能和品质在实际运行中不断改进和完善。相信在不远的将来，实验室里常规配备的是国产显微镜，仪器平台运行的是品质优异的国产激光共聚焦显微成像系统和国产流式细胞分析分选仪，大型共享技术平台能有更多的国产高端仪器，彻底摆脱卡脖子困境。除此之外，面向未来的科研发展范式，大型科研仪器的运行管理也将会成为一门需要科研人员、技术人员和管理人员认真钻研的学科。

本文作者：

张文娟 中科院分子细胞科学卓越创新中心 公共技术中心常务副主任，高级工程师

张文娟，中科院分子细胞科学卓越创新中心公共技术中心常务副主任，高级工程师。2007年于复旦大学获得生物信息学博士学位， 2007年-2012年先后在复旦大学及美国贝勒医学院从事表观遗传学博士后研究工作。曾获中国博士后科学基金、2006年度上海市科技进步2等奖。2008年，被世界500强美国Honeywell公司上海总部研发中心聘为科学顾问（兼）。 2009年获The Lalor Foundation Travel Award，2011和2012年为International Society for Developmental Origins of Health and Disease（DOHaD）会员。2012年9月回国担任中科院生化与细胞所科研处副处长（副研究员）,2013年8月起全面主持科研处工作。2015年2月起担任条件建设管理中心主任/公共技术服务中心执行副主任（高级工程师），2017年起任科技条件处处长/上海生命大型仪器区域中心管委会办公室主任。主要负责技术平台管理体系及条件建设的整体规划与组织实施，统筹科研设备和试剂耗材采购，协调装备研制项目管理。2019年度获上海市大型科学仪器设施共享服务先进个人（管理类）。2019年起任《分析测试技术与仪器》第八届编委。

边玮：中科院分子细胞科学卓越创新中心 细胞分析技术平台主任

边玮：中科院分子细胞科学卓越创新中心细胞分析技术平台主任。2004年参与筹建细胞分析技术平台，致力于平台的基础建设、人才队伍建设、技术建立和新技术发展，全面负责细胞分析技术平台的运行管理和服务共享。擅长激光共聚焦显微成像、超高分辨率荧光显微成像、活细胞成像、多光谱荧光成像、透明化样品光片成像、组织切片高通量扫描成像和实验室培养细胞及组织切片制样技术，熟悉流式细胞检测分析分选技术、电子显微镜生物样品制备和成像、实验室用超纯水系统等相关大型仪器分析技术，高度关注相关仪器设备和行业技术发展状态。作为项目负责人承担三项中科院仪器设备功能开发项目，两项上海市专业技术人才知识更新工程急需紧缺人才培养项目。现任上海显微学学会理事会理事，生命科学专业委员会主任。中国电子显微学学会理事会理事。《生命的化学》杂志编辑委员会编委。

关于中国科学院分子细胞科学卓越创新中心

中国科学院分子细胞科学卓越创新中心（简称分子细胞卓越中心）成立于2015年，依托中国科学院原上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所（简称生化与细胞所）建设及管理。

分子细胞卓越中心致力于生命科学前沿基础研究与应用基础研究，依托分子生物学国家重点实验室、细胞生物学国家重点实验室、上海市分子男科学重点实验室，开展基因调控、RNA与表观遗传学，蛋白质科学，细胞信号转导，细胞与干细胞生物学，癌症和其他重大疾病机理等领域的研究。2020年，中心以第一单位/通讯作者发表高水平论文144篇；IF≥10的代表性论文76篇，其中Cell 3篇、Nature Methods 1篇、Nature Genet 1篇、Cancer Cell 4篇、Immunity 1篇、Nature Cell Biology 1篇、Cell Research 5篇。