瑞典皇家科学院10月5日宣布,将2022年诺贝尔化学奖授予科学家
Carolyn R. Bertozzi、Morten Meldal和K. Barry Sharpless,以表彰他们在“
点击化学和生物正交化学”方面所做出的贡献。
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CR. Bertozzi是第一个提出生物正交反应概念的人。生物正交反应是指在活体细胞或组织中,能够在不干扰生物自身生化反应条件下可以进行的化学反应,是化学生物学中非常重要的工具。生物正交反应必须发生在复杂的生命条件下,与点击反应一样温和且高效,且具有高选择性。
那么生物正交反应和近期火热的免疫治疗有什么关系呢?
CR. Bertozzi课题组就用这种反应将唾液酸酶和一种抗体药物(曲妥珠单抗)偶联物T-Sia 2形成一种新的免疫检查点抑制剂疗法,并在《Nature》子刊上发表了题为
Targeted glycan degradation potentiates the anticancer immune response in vivo [1]的文章(以下用“该文”表示)。
唾液酸酶的作用
唾液酸残基(基本单糖结构单元之一)在肿瘤细胞中上调,与受体Siglecs结合可形成免疫抑制效果。而唾液酸酶可以除掉这些唾液酸,阻断Siglecs-唾液酸的相互作用。
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唾液酸酶-抗体偶联作为免疫检查点抑制剂示意图
抗体和唾液酸酶的偶联方式就是著名的生物正交反应——具有张力的环状炔与叠氮的无金属催化的点击反应。
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生物正交反应示意图
在偶联抗体生成后仍需要面临两个问题:酶和抗体之间linker是否稳定?考虑到抗体需要有ADCC等效应来杀死肿瘤,修饰后的抗体是否还有Fc受体的结合活性?
该文使用Sartorius的
Incucyte® 实时活细胞分析系统进行linker稳定性分析。
用荧光基团标记不同linker(oxime或HIPS)偶联抗体,可通过荧光强弱与荧光持续性判断linker的稳定性。使用Incucyte® 进行活细胞实时成像,发现HIPS比较稳定,同时克服了抗体和酶之间先前使用的肟键的不稳定性。
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Incucyte®每隔2小时拍摄,动态观察细胞内抗体linker荧光的持续情况(稳定性),10倍镜(图cde)
C 图 正常培养基活细胞培养;
D 图 加入蛋白酶抑制剂活细胞培养;
E 图 固定细胞;
HIPS为红色,oxime为蓝色。
分析参数:
使用Top-Hat减噪算法半径为100-μm;
荧光阈值:0.2 RCU;
边界灵敏度 −25;
中空填充:200 μm2;
最大面积 2,600 μm2 ;
使用积分荧光面积输出结果。
抗体和Fc受体的结合活性作为抗体药物的重要表征方法,该文通过
Octet® 非标记分子互作系统进行分析。发现偶联后的抗体药物(T-Sia2)与Fc受体的亲和力与未偶联的药物类似。
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Octet® RED 96数据
用链霉亲和素传感器(SA)固化生物素化的Fc受体,与100 nM的抗体或者抗体偶联物结合20 s,解离40 s。
在制备一些对照蛋白的时候,也用到了Octet® 检测其与Fc受体的亲和力(数据未列出)。
T-Sia 2在移植了同系HER2+癌细胞的小鼠模型中,作者观察到肿瘤生长延迟,并且证明与肿瘤唾液酸减少有关。在动物试验中也说明了这种方法的可行性。生物正交反应在活细胞成像、药物可控靶向释放、抗体药物偶联,甚至聚合物化学、材料表面化学领域均有应用,而该文就是在抗体药物偶联中的一个案例。
CR. Bertozzi课题组在多篇文章中都使用了
Incucyte® 实时活细胞分析系统和
Octet® 非标记分子互作系统。好马配好鞍,Octet® 和Incucyte® 不愧为2022年诺奖得主都在用的实验神器!那为什么大家都争先恐后的使用这两款神器呢?
使用Incucyte® 实时活细胞分析系统的优势
培养箱内可长达数周的连续观察,最短几分钟间隔拍摄,减少人力,防止过多操作对细胞的伤害;如该文每隔2个小时拍摄,共拍摄4天。
6个板位,分别独立设置检测程序,可以兼容各种孔板和培养皿,通量高;如该文有各种免疫抑制剂、效靶比等实验组,Incucyte® 一次可以完成所有实验组实验。
高效简便的模块化软件设置和数据分析,输出图片、视频、生长曲线等多指标多参数;该文提到了使用Incucyte®多个参数的调节,使得结果更加准确。
大于100种优化过的活细胞专用荧光试剂、耗材及详尽的Protocol,文章数大于12000篇。
使用Octet® 非标记分子互作系统的优势
- 非标记Direct Binding是趋势,它的结果更加准确。
- 快速测定亲和力,更加定量化对互作进行表征。
- 无洗涤步骤,可测弱亲和力(解离快);如该文Fc受体解离快,无法用带洗涤的传统方法建立结合活性检测。
- 测试时间短,一般10分钟,更快拿到结果;如该文5分钟就可以完成实验。
- 实验形式多样化:定性,两者结合,协同/竞争实验,垂钓。
- 写入美国药典,文章>10000篇,认可度广。
- 万金油技术,可以用与检测DNA、小分子、蛋白等各种生物分子。
- 使用方便,成本相对较低。
再好的idea与成就,也需要用强有力的手段和工具去实现,Incucyte® 实时活细胞分析系统和Octet® 非标记分子互作系统,来自诺奖得主的制胜法宝!
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-参考文献-
[1]Carolyn R. Bertozzi et al.Targeted glycan degradation potentiates the anticancer immune response in vivo.Nature Chemical Biology volume 16, pages1376–1384 (2020)