流式大咖说|流式分选应用中喷嘴的选择——上海科技大学高级工程师任晓越

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本期，上海科技大学生命科学与技术学院高级工程师任晓越老师带我们学习流式分选应用中喷嘴的选择。

流式分选应用中喷嘴的选择

上海科技大学生命科学与技术学院 高级工程师 任晓越

流式细胞术（Flow Cytometry，简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且能够同时检测快速直线流动状态中单个细胞的多项物理及生物学特性，加以分析定量的技术。流式细胞分选是在流式细胞术的基础上，对包含有目的细胞的液滴充以电荷，在电场作用下发生偏转进入收集管中，从而达到对特定群体分选的目的。

在进行分选实验时，通常我们都希望能够以最快的分选速度，获得最佳的分选结果。最佳的分选结果，就是细胞活性、目的细胞的纯度、细胞功能性都能获得满足，同时能获得到最多的细胞数量。

那么为了获得最佳的分选结果，我们就要考虑影响细胞分选的因素有哪些？首先，样本制备过程当然非常重要，做好样品制备对后续上机分选影响很大。当然，液滴形成，流式检测，圈门，分选模式选择，样本如何收集都会影响分选结果。在这里就不一一展开来讲，那么对液滴形成其关键作用的喷嘴，又是如何影响分选实验。

目前，流式分选仪配套的喷嘴规格有70、85、100、130。从表1中，我们可以看出，不同规格的喷嘴对应着不同的鞘液压力和振动频率。喷嘴尺寸越大，相应的鞘液压力就越小，相应的对细胞压力也会减小，细胞活性就会提高。振荡频率Frequency决定了每秒能形成的液滴数，frequency数值越高，每秒形成的液滴数越多，按照每4个液滴分配一个细胞，上样的浓度就能增加，可以提供分选效率，但是液滴数越多，液滴就会越小，对于较大的细胞就会有包裹不好的情况。

Nozzle diameter	Sheath pressure	Frequency	Flow rate
70μm	70 PSI	80-90 KHz	~20000 Events/s
85μm	45 PSI	40-50 KHz	~10000 Events/s
100μm	20 PSI	30-40 KHz	~8000 Events/s
130μm	10 PSI	12-16 KHz	~3000 Events/s

表1 BD AiraIII不同规格喷嘴的分选条件

综上，我们可以得出这样结论，对于分选得到的细胞活性方面，70μm<85μm<100μm<130μm，在分选速度方面70μm>85μm>100μm>130μm。

通常情况下，进行分选实验时，选择喷嘴的标准为：细胞直径小于喷嘴直径的1/5。那么这一标准是否固定不变？

从众多的使用案例中，我挑选了三个代表性的实验来和大家分享。

70μm喷嘴分选小鼠骨髓造血干细胞

造血干细胞(Hematopoietic stem cells, HSCs)是一种主要存在于骨髓中的多能干细胞，具有长期自我更新的能力和分化成各类成熟血细胞的潜能。造血干细胞是研究历史最长最为深入的一类成体干细胞，对研究各类干细胞具有重要指导意义。HSCs是多功能的，它们可以分化为所有类型的血细胞，还能不断繁殖以维持自身在骨髓中的数量。它可以分化为多能祖细胞，进一步分化成淋巴祖细胞，分化为NK细胞、B细胞、T细胞；也能分化为髓系祖细胞，进而分化为粒细胞/巨噬祖细胞，以及巨核系-红系祖细胞，这些祖细胞会继续分化形成巨噬细胞、单核细胞、粒细胞、红细胞和巨核细胞。

我们为什么使用70μm喷嘴分选造血干细胞，首先造血干细胞是比较小的，大约仅有8μm，其次，在小鼠骨髓中，HSCs在有核细胞中的比例仅有0.01%。即使年龄、性别、小鼠品系及纯化方法的存在差别，1只小鼠也只能分离到大约几千到1万个左右HSCs。使用70喷嘴可以极大的提供分选效率，缩短分选时间。

图1 小鼠骨髓造血干细胞的流式分选

100μm喷嘴分选小鼠原代肝实质细胞

这个实验是将Cas13d系统和靶向Pten基因的guide RNA作为载体，通过高压尾静脉注射方法，导入到小鼠肝脏中表达。这段载体中包含GFP基因，所以将GFP+肝细胞通过流式细胞仪分选出来。再进行后续试验，才能确定是否在肝脏细胞中沉默Pten基因。

图2 小鼠原代肝实质细胞的流式分选

因为肝实质细胞比较大，所以文献中也常会用130μm的喷嘴分选。但是肝脏中大概有1010方个hepatocytes，数量庞大，而且高压尾静脉注射这种方法递送效率比较低，GFP+肝实质细胞比例偏低。如果，我们也使用130喷嘴分选，分选时间会太长。所以，我们分别用100、130喷嘴来测试，发现虽然100喷嘴分选到细胞活性可能会收到影响，但是后续试验都要把分选到的细胞直接裂解掉，所以对细胞活性要求不高。而使用100的喷嘴可以显著缩短分选时间，提高效率。最终确定用100喷嘴分选肝实质细胞，在分选过程中，由于肝细胞在液滴中偏大，测液流周围会有很多卫星液滴，这对后续实验没有影响。

130μm喷嘴分选成年小鼠的神经元

实验目的是去除鞘髓碎片和无荧光细胞，分选到有荧光的细胞后续用于单细胞测序，所以对神经元活性要求高，而神经元又是非常脆弱的。为了尽可能的保证神经元的活性， 用人工脑脊液替代鞘液，使用130μm喷嘴分选成年小鼠的神经元。清洗鞘液桶，用人工脑脊液润洗桶壁，加入鞘液桶1/2体积以上人工脑脊液，进行液流启动，替代管路中的鞘液；set configuration，将鞘液压力调整为10PSI，（根据所使用鞘液粘稠度，调节鞘液压力）。

图3 成年小鼠神经元的流式分选

从图3中看到，在加电分选中，看到侧液流很集中，说明液滴包裹的比较好。

总结一下，我们该如何选择一个合适的喷嘴？首先，细胞的大小当然是很关键关键；其次，我们也可以考量下游实验对于细胞活性和细胞量的要求。比如体外培养、体内移植、单细胞测序对细胞活性要求较高，就可以尽量选择较大的喷嘴；而测量蛋白和mRNA表达水平，对细胞活性要求就较低，可以选小一些的喷嘴，提高分选效率。

【作者简介】

上海科技大学生命科学与技术学院 高级工程师 任晓越

任晓越，上海科技大学生命科学与技术学院，高级工程师。2013年毕业于天津大学化工学院制药工程专业，工学硕士。在平台负责流式细胞仪、大颗粒分选装置、超速离心机等大型设备的管理工作，熟悉和掌握多种流式细胞仪的操作使用，为用户提供仪器辅助、操作培训、多色配色、数据分析等仪器相关服务。

（本文编辑：刘立东）

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