技术流派解析：带你重新认识酶标仪（上）

酶标仪即酶联免疫检测仪，酶标仪检测技术是一种高通量微孔板检测技术，操作简便，被广泛应用于生命科学、生物制药、体外诊断、食品安全、环境科学等领域。

传统酶标仪是指具备吸收光检测功能的酶联免疫检测仪，随着科学技术发展和市场需求不断丰富，如今酶标仪所具备的检测功能日益丰富，在吸收光检测(Abs)基础上增加了荧光强度(FI)、发光检测(Lum)、荧光偏振(FP)、时间分辨荧光(TRF)、匀相时间分辨荧光(HTRF)以及Alpha检测等多种检测技术。

然而每一种技术都具有独特的应用价值和局限性，笔者将主流的酶标仪检测技术进行汇总，分为上、下两篇，以飨读者。

1.吸收光检测（Absorbance,Abs）

早期的酶标仪实际上是一台变相的专用光电比色计或分光光度计，其工作原理与主要结构和光电比色计基本相同，在特定波长下检测到的被测物的吸光值。光通过被检测物前后的能量差异即为被检测物吸收掉的能量，特定波长下，同一种被检测物的浓度与被吸收的能量成定量关系，即符合朗伯比尔定律。

检测时，光波由光源灯发射并经过滤光片或单色器变成一束单色光，照射到微孔板中的待测样本，一部分光被样本吸收，另一部分则透过样本照射到光电检测器上，光电检测器将不同待测样本的强弱不同的光信号转换成相应电信号，再经信号处理后送入微处理器进行数据处理和计算，最后由显示器显示结果。

光吸收酶标仪的技术原理示意图（图源网络）

典型应用：核酸和蛋白质定量、ELISA、酶学检测、细菌生长OD600测定、LAL内毒素检测、MMT/CCK8等细胞活力分析。

2.荧光强度（Fluorescence Intensity,FI）

荧光是发光体分子中处于激发态的原子核外电子由高能级回到低能级所产生的辐射，因此是冷光。荧光的颜色多为蓝色、绿色、红色和黄色等。荧光强度即发射荧光的光量子数，荧光强度与溶液吸收光强度，荧光量子效率以及周围环境等因素有关。当其他因素保持不变，荧光强度与该物质溶液的浓度成正比，这也是荧光检测的定量依据。

荧光酶标仪通常包含光源、用于选择激发光的光学系统（即滤光片和/或光栅）、用于选择发射光的第二光学系统以及检测器。检测时，采用特定波长激发光来激发样品孔内的荧光标志物，通过检测器检测荧光物质被激发产生的发生光。

荧光检测系统光路示意图（图源网络）

典型应用：核酸等生物大分子定量、酶活性分析、荧光免疫分析、细胞学分析（细胞增殖、细胞毒理、细胞吸附等）、胞内钙离子浓度的变化、荧光蛋白的报道基因分析 (GFP)、细胞凋亡等。

3.发光检测（Luminescence,Lum）

发光检测包括化学发光（Chemiluminescence）和生物发光(Bioluminescence)，是样本孔内发生的化学、生化或者酶反应发出的光信号。与吸收光和荧光检测不同的是，发光检测不需要激发光源，这就使得发光更敏感，更不容易引起背景噪音。

化学发光是由化学反应引起的一种特殊的发光现象，即通过氧化还原反应释放的能量将体系中某一物质从基态跃迁至激发态，随后以辐射发光（紫外光、可见光或近红外光）的形式返回基态释放能量。化学发光由化学激发过程和发光过程两部分组成。根据能量作用过程，化学发光主要分为直接发光和间接发光两类。

化学发光的两种类型（图源网络）

生物发光是生物体内的发光蛋白通过消耗能量物质而产生的发光现象，其特点是只消耗能量物质,不消耗发光物质。生物发光属于冷光范畴,即发光不是由于发光体温度升高所致,发射波长也与其温度无关。目前被发现的生物发光底物有虫荧光素、腔肠素、虾素等。

典型应用：单/双荧光素酶报告基因、BRET、细胞活力检测、细胞增殖检测、支原体检测、细胞毒性检测、ATP、dsDNA、水母发光蛋白Ca2+、基于化学发光的ELISA检测等。

4.荧光偏振（Fluorescence polarization,FP）

1926年，Perrin首先描述了荧光偏振理论，以单一波长偏振光照射溶液中的荧光物质，当荧光分子受平面偏振光激发时，如果分子在受激发时期（对于荧光素约持续4纳秒）保持静止，发射光将位于同样的偏振光平面；如果在受激发时期，分子旋转或翻转偏离这一平面，发射光将位于与激发光不同的偏振面，即荧光的去偏振现象。

荧光偏振检测技术通过分析体系中荧光分子的偏振信号变化差异，实现对分子间相互作用的研究以及所选目标物的检测，其计算依据为荧光偏振光强度与待检测物质含量呈正相关性。

检测时，荧光物质标记在特定物质上使原本微弱的反应信号转化成较强的荧光信号，起到信号增强的作用。与此同时，在检测系统中加上起偏器和检偏器，当从光源发出的一束光线经垂直起偏器后成为垂直偏振光，样品被垂直偏振光激发而产生偏振荧光，此荧光经检偏器后可测出与样品浓度有关的水平或垂直方向的荧光偏振光强度。

荧光偏振信号测量原理（图源网络）

典型应用：受体/配体研究（如激素/受体检测），蛋白质/多肽相互作用，DNA/蛋白质相互作用，酪氨酸激酶检测，竞争性免疫检测、单核苷酸多态性筛选、实时定量PCR-FP、体外细胞损失检测等。

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以上就是酶标仪吸收光检测(Abs)、荧光强度(FI)、发光检测(Lum)和荧光偏振(FP)检测技术盘点。下期，我们将为广大用户盘点荧光共振能量转移（FRET）、时间分辨荧光(TRF)、匀相时间分辨荧光(HTRF)以及Alpha检测等多种酶标仪检测技术。(点击查看)。

参考资料：

1.An Improved Automated High-Throughput Efficient Microplate Reader for Rapid Colorimetric Biosensing

2.多功能分析仪技术研究

3.Chemiluminescence for bioimaging and therapeutics: recent advances and challenges

4.荧光偏振技术在生化分析检测中的研究进展

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