导读:自上而下的质谱技术近年来在单克隆抗体的表征中得到了广泛的应用,与自下而上质谱(BU-MS)和中下质谱(MD-MS)相比,TD-MS具有最简单的样品制备流程和保留单克隆抗体内源性修饰的优势。
大家好,本周为大家分享一篇文章,Added Value of Internal Fragments for Top-Down Mass Spectrometry of Intact Monoclonal Antibodies and Antibody−Drug Conjugates[1],文章的通讯作者是加州大学洛杉矶分校化学与生物化学系的Joseph A. Loo教授。
抗体-药物偶联物(Antibody - drug conjugates, ADC)是一种很有前景的治疗药物,它通过linker为抗体提供高效的细胞毒性有效载荷,以提高其抗肿瘤功效。将linker和有效载荷偶联到抗体上,给ADC带来了额外的异质性,增加了对其全面表征的挑战。自上而下的质谱(TD-MS)技术近年来在单克隆抗体的表征中得到了广泛的应用,与自下而上质谱(BU-MS)和中下质谱(MD-MS)相比,TD-MS具有最简单的样品制备流程和保留单克隆抗体内源性修饰的优势。然而,对于抗体大小的蛋白质和具有显著二硫键组成的蛋白质,TD-MS的断裂效率较低,获得的序列和药物偶联位点信息有限。
为了增加TD-MS的序列信息含量,一种策略是将不包含蛋白质序列N端和C端的内部片段纳入数据分析工作流程中,这种方法已被证明有助于二硫化完整蛋白的TD-MS表征。在这篇文章中,作者发现在TD-MS中分配内部片段将mAb序列覆盖率提高到75%以上,并允许确定链内二硫键连接和各种N-糖基化类型。对于治疗性非特异性赖氨酸连接ADC,几乎60%的假定药物偶联位点被识别。
内部片段可以在不破坏二硫键的情况下进入结构紧密、碎片化效率高度受限的区域,因此有可能大大增强完整单克隆抗体的序列信息。作者对完整的NIST单抗的5个最丰富的电荷态采用了ECD和HCD两种碎片化方法,并将每个电荷态的两种碎片化方法的TD-MS结果结合分析。内部片段的纳入提高了二硫键约束区域的序列覆盖,例如,轻链Cys133和Cys193之间的二硫约束序列几乎完全由内部片段覆盖(图2A),重链的Cys147-Cys203和Cys264-Cys324序列区也是如此(图2B),而这些区域是末端片段难以触及的。CDR的覆盖率从53%增加到60%,这表明纳入内部片段可以更深入地了解这一关键区域。总体来说,轻链的序列覆盖率从54%提高到83%,重链从28%提高到72%,合并后整个NIST单抗的序列覆盖率从36%增加到76%(图1)。重链比轻链的覆盖率提高更为显著,这表明随着蛋白质分子量增大,分配内部片段变得更有价值。
图1. 考虑(A)轻链、(B)重链和(C)全单抗内部片段前后不同序列区域的序列覆盖率,包括非二硫约束序列(Free)、二硫约束序列(SS-constrained)、全序列(Full)和CDR序列(CDR)
图2. (A)轻链和(B)重链的NIST mAb序列覆盖图谱。蛋白质骨架上的蓝色、红色和绿色切割分别代表b/y、c/z·和by/cz·片段。序列上方的实线表示末端片段序列覆盖率,序列下方的实线表示内部片段序列覆盖率。紫色虚线表示链内二硫键,浅灰色表示受二硫键约束的序列区域,橙色表示互补决定区域(cdr)。
HCD能够在不破坏二硫键的同时仅碎裂蛋白质主干,因此作者在完整的NIST单抗上应用HCD来生成含有完整二硫键的片段,以确定二硫键连接。在每个形成链内二硫键的半胱氨酸上应用-1H的修饰,以表明它们的完整性。对于轻链,52个末端片段和12个内部片段穿过S - S键I, 17个末端片段穿过S - S键II, 6个末端片段穿过两个二硫键,清楚地显示了这两个二硫键的连接模式(图3A)。靠近重链两端的两个二硫键,S - S键I和S - S键IV,被89个末端片段和9个内部片段穿过;而中间的两个二硫键,S−S键II和S−S键III,只有24个内部片段穿过,没有末端片段穿过(图3B,C)。这些结果证明了NIST单抗重链的链内S - S连通性,重要的是,中间的两个S - S键模式只能由内部片段确定。除了确定链内S - S连通性外,分配内部片段也有助于鉴定N糖基化。当纳入内部片段时,额外分配了25个含有G0F的片段,42个含有G1F的片段和34个含有G2F的片段,这表明分析内部片段对N-糖基化鉴定的能力。
图3. (A)轻链、(B)重链、(C)仅含完整NIST单抗内部片段的重链,在每个形成链内二硫键的半胱氨酸上施加一个氢损失后,通过HCD TD-MS生成片段位置图。
内部片段可以确定赖氨酸连接ADC的药物偶联位点。作者采用了类似的方法,将ECD和HCD应用于先前已充分表征的非特异性赖氨酸连接ADC。ADC的TDMS在轻链上仅产生8个与DM1结合的末端片段(图4A)。分配内部片段显著提高了DM1偶联位点的测定。ADC的TD-MS在轻链上产生61个1- dm1结合和15个2 - dm1结合的内部片段,定位了3个偶联位点(K106, K114, K133),并将鉴定的两个偶联位点缩小到4个赖氨酸残基(K153, K160, K170, K175)(图4A)。对于重链也观察到类似的结果。综上所述,对于完整的ADC,仅用末端片段确认了16个偶联位点,而在包含内部片段后,这一数字增加到52个,覆盖了约58%的抗体所有假定的偶联位点。
图4. 由ECD和HCD TDMS生成的完整IgG1-DM1 ADC (A)轻链和(B)重链片段位置图。黑色垂直虚线表示赖氨酸的位置。
在这项工作中,作者首次报道了在完整的NIST单抗和异质赖氨酸连接ADC的TD-MS表征中分析内部片段的好处。内部片段的包含末端片段难以达到的二硫键约束区域,显著增加了完整单克隆抗体的序列覆盖率。重要的PTM信息,包括二硫键模式和N糖基化,可以通过包含内部片段获得。最重要的是,内部片段可以帮助确定高度异质赖氨酸连接ADC的药物偶联位点。
撰稿:夏淑君
编辑:李惠琳
文章引用:Added Value of Internal Fragments for Top-Down Mass Spectrometry of Intact Monoclonal Antibodies and Antibody-Drug Conjugates
来源于:仪器信息网
热门评论
最新资讯
新闻专题
更多推荐