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　　一. 测序仪对比

测序技术	代表仪器	读长	通量	准确度	成本
Sanger法	ABI 3730xl DNA Analyzer	500-800bp	0.096Gbp/天	>99.99%	0.24美分/bp
Illumina	HiSeq X Ten System	150bp	1800Gbp/运行	>99.9%	0.01美分/bp
华大智造	MGISEQ-2000	200bp（单端）或2×150bp（双端）	60Gbp/运行	>99.9%	0.015美元/bp
Roche 454	GS FLX+ System	700bp	0.7Gbp/运行	>99.9%	0.02美元/bp
ABI SOLiD	SOLiD System 5500xl	75bp	120Gbp/运行	>99.94%	0.13美分/bp
PacBio	Sequel II System	>10kb	60Gbp/运行	>99%	0.15美元/bp
Nanopore	MinION Device	>100kb	30Gbp/运行	>90%	0.02美元/bp
Helicos	HeliScope Single Molecule Sequencer	25-50bp	28Gbp/运行	<80%	未知

　　1. ABI 3730xl DNA Analyzer

图源自thermofisher官网

　　1.1. 相关原理

　　· DNA测序：基于Sanger法的原理，利用DNA聚合酶在体外DNA复制过程中随机掺入带有荧光标记和终止子的双脱氧核苷酸(ddNTPs)，从而得到不同长度的DNA片段。这些片段经过电泳分离后，通过激光激发和CCD检测，得到每个碱基发出的荧光信号，从而确定DNA的碱基序列。

　　· 片段分析：基于荧光检测的原理，利用不同颜色的荧光染料标记不同长度或类型的DNA片段，如微卫星、SNP、AFLP等。这些片段经过电泳分离后，通过激光激发和CCD检测，得到每个片段发出的荧光信号，从而确定片段的大小或等位基因。

　　1.2. 主要组成

　　ABI 3730xl DNA Analyzer仪器是一种高通量的DNA测序和片段分析的平台，它可以同时使用48或96根毛细管进行电泳分离和荧光检测。

　　· 测序仪主机：包含电泳系统、自动进样系统、激光系统、光学系统、温控系统、聚合物输送系统等多个模块，用于控制仪器的运行和数据的采集。

　　· 计算机工作站：预装用于仪器控制、数据收集和样品文件自动分析的软件，如Data Collection Software、Sequencing Analysis Software、SeqScape Software、GeneMapper Software等。

　　· 毛细管阵列：提供预组装的48根或96根毛细管阵列，它们与业界标准的96孔和384孔板配合使用。毛细管为内部无涂层毛细管，可提供300次的运行质保。

　　· DNA测序试剂和耗材：包括BigDye Terminator循环测序试剂盒、GeneScan分子量标准品、片段分析标准品、POP-7聚合物分离胶等。

　　1.3. 主机模块

　　· 电泳系统：负责将DNA片段在毛细管中进行电泳分离，根据不同长度的DNA片段在电场中的迁移速度不同，将它们按照从小到大的顺序排列。电泳系统由高压电源、电泳缓冲液、毛细管阵列等组成。

　　o 高压电源：提供高达30kV的电压，使DNA片段在电场中迁移。

　　o 电泳缓冲液：提供电导性和pH稳定性，使DNA片段在毛细管中顺利运行。

　　o 毛细管阵列：提供预组装的48根或96根毛细管，它们与业界标准的96孔和384孔板配合使用。毛细管为内部无涂层毛细管，可提供300次的运行质保。

　　· 自动进样系统：负责将样品从96孔或384孔板中自动吸取，并注入到毛细管阵列中。自动进样系统由进样针、进样泵、进样阀等组成。

　　o 进样针：用于从样品板中吸取样品，并通过进样阀将样品注入到毛细管中。

　　o 进样泵：用于控制进样针的吸取和释放动作，以及进样量的大小。

　　o 进样阀：用于控制进样针与毛细管之间的连接和断开，以及进样时间的长短。

　　· 激光系统：负责将激光光束照射到毛细管阵列的出口处，激发荧光信号。激光系统由激光器、光纤、光学开关等组成。

　　o 激光器：提供单波长、505nm、固态、长寿命的激光光源，用于激发荧光染料。

　　o 光纤：用于将激光光束从激光器传输到毛细管阵列上。

　　o 光学开关：用于控制激光光束的开启和关闭，以及激光功率的大小。

　　· 光学系统：负责将荧光信号收集并转换为电信号。光学系统由滤光片、透镜、CCD相机等组成。

　　o 滤光片：用于选择不同颜色的荧光信号，并过滤掉背景噪声。

　　o 透镜：用于聚焦和放大荧光信号，并将其投射到CCD相机上。

　　o CCD相机：用于将荧光信号转换为数字化的电信号，并传输给计算机工作站进行数据采集和分析。

　　· 温控系统：负责控制仪器的温度，保证测序的稳定性和可靠性。温控系统由温度传感器、风扇、加热器等组成。

　　o 温度传感器：用于监测仪器内部和外部的温度，并反馈给温控器进行调节。

　　o 风扇：用于散热和通风，维持仪器的适宜温度。

　　o 加热器：用于加热和保温，防止仪器的过冷。

　　· 聚合物输送系统：负责将聚合物分离胶从储存瓶输送到毛细管阵列中，作为电泳介质。聚合物输送系统由压力罐、气压调节器、流量计等组成。

　　o 压力罐：用于储存聚合物分离胶，并提供一定的压力，使聚合物分离胶能够流动。

　　o 气压调节器：用于控制压力罐的气压，以及聚合物分离胶的流速。

　　o 流量计：用于测量聚合物分离胶的流量，以及毛细管中的胶量。

　　2. HiSeq X Ten System

图源自Illumina官网

　　HiSeq X Ten System是Illumina公司的产品。Illumina是一家生物技术公司，它的测序仪是基于桥式PCR和荧光检测的技术，也是目前最流行的二代测序平台之一。它的测序仪有多个系列，如NovaSeq、HiSeq、MiSeq、MiniSeq等，它们的核心技术原理是相同的，但在通量、读长、准确度、成本等方面有所不同。

　　2.1. 相关原理

　　· 文库构建：将待测DNA打断成小片段，并在两端加上特殊的接头(Adaptor)，这些接头包含与流通池表面探针互补的序列(P5/P7)、用于区分不同文库的索引(Index)、以及用于测序引物结合的序列(Rd1 SP/Rd2 SP)。文库构建后需要进行质量检测和定量。

　　· 聚集体生成：将文库DNA片段注入到流通池中，并与表面探针杂交结合。然后进行桥式PCR扩增，使每个DNA片段形成一个聚集体。聚集体生成后需要进行温度变化和化学处理，使其单链化并去除P5端的DNA链，只留下P7端的DNA单链。

　　· 边合成边测序：将带有荧光染料和可逆终止子的四种dNTPs逐一加入到流通池中，并利用DNA聚合酶将它们连接到聚集体的DNA链上。每次只能加入一个碱基，然后用激光激发荧光信号，并用CCD相机记录每个聚集体发出的荧光信号，从而确定碱基序列。然后用化学剂去除荧光染料和可逆终止子，使下一个碱基可以继续加入。重复这个过程，直到完成所有的测序循环。

　　· 数据分析：将CCD相机收集到的荧光信号转换为原始数据(BCL文件)，并进行质量控制和过滤，去除低质量的聚集体和信号。然后根据索引将不同文库的数据分离，并进行碱基识别(Base calling)，将荧光信号转换为碱基序列(FASTQ文件)。最后根据不同的测序目的，进行后续的数据分析，如比对、变异检测、表达量计算等。

　　2.2. 主要组成

　　· 流通池(Flow cell)：是一个微型的玻璃芯片，它的表面覆盖了数亿个固定在不同位置的寡核苷酸探针，这些探针与文库DNA片段的接头互补，可以通过杂交结合。流通池内部有多个通道，每个通道可以进行不同的测序反应。

　　· 聚集体(Cluster)：是指通过桥式PCR在流通池表面扩增形成的由相同DNA片段组成的簇，每个聚集体可以发出荧光信号，从而被检测为一个读长(Read)。聚集体的密度和质量会影响测序的效率和准确度。

　　· 荧光染料(Fluorescent dye)：是指用于标记不同碱基的四种荧光分子，它们分别对应A、T、C、G四种碱基，并发出不同颜色的光。荧光染料还带有可逆终止子，可以控制每次只加入一个碱基。

　　· 激光器(Laser)：是指用于激发荧光染料发光的光源，它可以提供单波长、固态、长寿命的激光光束。

　　· CCD相机(CCD camera)：是指用于捕捉和记录荧光信号的设备，它可以将荧光信号转换为数字化的电信号，并传输给计算机进行数据分析。

　　· 计算机系统(Computer system)：是指用于控制测序仪运行和处理数据的设备，它预装了用于仪器控制、数据收集和样品文件自动分析的软件，如BaseSpace Sequence Hub、Sequencing Analysis Software等。

　　3. MGISEQ-2000

图源自华大智造官网

　　MGISEQ-2000测序仪是一种基于荧光检测的第二代测序技术，可以实现高通量、高精度、低成本的基因组测序。

　　3.1. 相关原理

　　o DNA测序：基于双端测序的原理，利用DNA聚合酶在体外DNA复制过程中随机掺入带有荧光标记和终止子的双脱氧核苷酸(ddNTPs)，从而得到不同长度的DNA片段。这些片段经过桥式扩增后，形成单分子簇，然后通过四色荧光检测，得到每个碱基发出的荧光信号，从而确定DNA的碱基序列。

　　o 片段分析：基于荧光检测的原理，利用不同颜色的荧光染料标记不同长度或类型的DNA片段，如微卫星、SNP、AFLP等。这些片段经过桥式扩增后，形成单分子簇，然后通过四色荧光检测，得到每个片段发出的荧光信号，从而确定片段的大小或等位基因。

　　3.2. 主要组成

　　o 测序仪主机：包含流体控制系统、温控系统、激光系统、光学系统、信号采集系统等多个模块，用于控制仪器的运行和数据的采集。

　　§ 流体控制系统：负责控制样品和试剂的输送，以及测序反应的进行。流体控制系统由进样针、进样泵、进样阀等组成。

　　§ 进样针：用于从样品板中吸取样品，并通过进样阀将样品注入到芯片上。

　　§ 进样泵：用于控制进样针的吸取和释放动作，以及进样量的大小。

　　§ 进样阀：用于控制进样针与芯片之间的连接和断开，以及进样时间的长短。

　　§ 温控系统：负责控制仪器和芯片的温度，保证测序的稳定性和可靠性。温控系统由温度传感器、风扇、加热器等组成。

　　§ 温度传感器：用于监测仪器和芯片内部和外部的温度，并反馈给温控器进行调节。

　　§ 风扇：用于散热和通风，维持仪器和芯片的适宜温度。

　　§ 加热器：用于加热和保温，防止仪器和芯片的过冷。

　　§ 激光系统：负责将激光光束照射到芯片上，激发荧光信号。激光系统由激光器、光纤、光学开关等组成。

　　§ 激光器：提供单波长、532nm、固态、长寿命的激光光源，用于激发荧光染料。

　　§ 光纤：用于将激光光束从激光器传输到芯片上。

　　§ 光学开关：用于控制激光光束的开启和关闭，以及激光功率的大小。

　　§ 光学系统：负责将荧光信号收集并转换为电信号。光学系统由滤光片、透镜、CCD相机等组成。

　　§ 滤光片：用于选择不同颜色的荧光信号，并过滤掉背景噪声。

　　§ 透镜：用于聚焦和放大荧光信号，并将其投射到CCD相机上。

　　§ CCD相机：用于将荧光信号转换为数字化的电信号，并传输给计算机工作站进行数据采集和分析。

　　§ 信号采集系统：负责对数字化的电信号进行滤波、校准、分段、碱基识别等处理，最终生成测序结果。信号采集系统由数据采集卡、数据处理软件等组成。

　　§ 数据采集卡：用于将CCD相机传输的电信号接收并转换为数字信号，以及进行一定的滤波和校准处理。

　　§ 数据处理软件：用于对数字信号进行进一步的分段、碱基识别、质量评估等处理，以及生成测序结果文件。

　　o 计算机工作站：预装用于仪器控制、数据收集和样品文件自动分析的软件。

　　o 芯片：芯片是MGISEQ-2000测序仪的核心部件，它是一种微流控芯片，上面有数百万个微孔，每个微孔都可以进行单分子簇测序，实现高通量的数据产出。芯片有不同的规格和类型，如单端测序芯片、双端测序芯片、片段分析芯片等，可以根据不同的需求选择合适的芯片。

　　4. GS FLX+ System

图源自罗氏官网

　　GS FLX+ System测序仪是一种基于焦磷酸测序(Pyrosequencing)技术的二代测序平台，它可以提供高通量、高准确度和超长读长的DNA测序服务。

　　4.1. 相关原理

　　· 文库构建：将待测DNA打断成小片段，并在两端加上特殊的接头(Adaptor)，这些接头包含与DNA捕获珠表面探针互补的序列(A/B)、以及用于测序引物结合的序列(P1/P2)。文库构建后需要进行质量检测和定量。

　　· 乳液PCR：将文库DNA片段与DNA捕获珠混合，并加入油相形成乳液滴。每个乳液滴中只包含一个DNA捕获珠和一个文库DNA片段。然后进行PCR扩增，使每个DNA捕获珠上形成一个单分子聚集体。乳液PCR后需要进行破乳液和洗涤处理，去除多余的油相和PCR试剂。

　　· PTP装载：将经过乳液PCR处理后的DNA捕获珠注入到PTP中，并使每个微孔中只有一个DNA捕获珠。然后进行温度变化和化学处理，使聚集体单链化并去除A端的DNA链，只留下B端的DNA单链。

　　· 边合成边测序：将带有荧光染料和可逆终止子的四种dNTPs逐一加入到PTP中，并利用DNA聚合酶将它们连接到聚集体的DNA链上。每次只能加入一个碱基，然后用激光激发荧光信号，并用CCD相机记录每个聚集体发出的荧光信号，从而确定碱基序列。然后用化学剂去除荧光染料和可逆终止子，使下一个碱基可以继续加入。重复这个过程，直到完成所有的测序循环。

　　· 数据分析：将CCD相机收集到的荧光信号转换为原始数据(SFF文件)，并进行质量控制和过滤，去除低质量的聚集体和信号。然后进行碱基识别(Base calling)，将荧光信号转换为碱基序列(FASTA/FASTQ文件)。最后根据不同的测序目的，进行后续的数据分析，如比对、变异检测、表达量计算等。

　　4.2. 主要组成

　　· 测序仪主机：包含电泳系统、自动进样系统、激光系统、光学系统、温控系统、聚合物输送系统等多个模块，用于控制仪器的运行和数据的采集。

　　· 计算机工作站：预装用于仪器控制、数据收集和样品文件自动分析的软件，如Data Collection Software、Sequencing Analysis Software等。

　　· PicoTiterPlate(PTP)：是一个微型的塑料板，它的表面覆盖了数百万个微孔，每个微孔可以容纳一个DNA捕获珠(DNA Capture Bead)，并进行单分子测序反应。

　　· DNA捕获珠(DNA Capture Bead)：是一种直径约28微米的磁性珠子，它的表面覆盖了数千个固定在不同位置的寡核苷酸探针，这些探针与文库DNA片段的接头互补，可以通过乳液PCR(Emulsion PCR)扩增形成单分子聚集体(Single Molecule Cluster)。

　　· 荧光染料(Fluorescent dye)：是指用于标记不同碱基的四种荧光分子，它们分别对应A、T、C、G四种碱基，并发出不同颜色的光。荧光染料还带有可逆终止子，可以控制每次只加入一个碱基。

　　· 激光器(Laser)：是指用于激发荧光染料发光的光源，它可以提供单波长、固态、长寿命的激光光束。

　　· CCD相机(CCD camera)：是指用于捕捉和记录荧光信号的设备，它可以将荧光信号转换为数字化的电信号，并传输给计算机进行数据分析。

　　4.3. 主机组成

　　· 电泳系统：是指用于将带有荧光染料和可逆终止子的四种dNTPs逐一加入到PTP中，并利用DNA聚合酶将它们连接到聚集体的DNA链上的系统。每次只能加入一个碱基，然后用激光激发荧光信号，并用CCD相机记录每个聚集体发出的荧光信号，从而确定碱基序列。

　　· 自动进样系统：是指用于将经过乳液PCR处理后的DNA捕获珠注入到PTP中，并使每个微孔中只有一个DNA捕获珠的系统。然后进行温度变化和化学处理，使聚集体单链化并去除A端的DNA链，只留下B端的DNA单链。

　　· 激光系统：是指用于激发荧光染料发光的光源，它可以提供单波长、固态、长寿命的激光光束。

　　· 光学系统：是指用于捕捉和记录荧光信号的设备，它可以将荧光信号转换为数字化的电信号，并传输给计算机进行数据分析。

　　· 温控系统：是指用于控制PTP板和反应液的温度，以保证测序反应的稳定性和效率的系统。

　　· 聚合物输送系统：是指用于将不同类型和浓度的聚合物溶液输送到PTP板中，以提供不同阶段所需的反应条件和试剂的系统。

　　5. SOLiD System 5500xl

图源自thermofisher官网

　　SOLiD System 5500xl测序仪是一种基于连接法测序(Sequencing by Ligation)技术的二代测序平台，它可以提供高通量、高准确度和中等读长的DNA测序服务。

　　5.1. 相关原理

　　· 文库构建：将待测DNA打断成小片段，并在两端加上特殊的接头(Adaptor)，这些接头包含与DNA捕获珠表面探针互补的序列(P1/P2)、以及用于测序引物结合的序列(Rd1 SP/Rd2 SP)。文库构建后需要进行质量检测和定量。

　　· 乳液PCR：将文库DNA片段与DNA捕获珠混合，并加入油相形成乳液滴。每个乳液滴中只包含一个DNA捕获珠和一个文库DNA片段。然后进行PCR扩增，使每个DNA捕获珠上形成一个单分子聚集体。乳液PCR后需要进行破乳液和洗涤处理，去除多余的油相和PCR试剂。

　　· FlowChip装载：将经过乳液PCR处理后的DNA捕获珠注入到FlowChip中，并使每个微孔中只有一个DNA捕获珠。然后进行温度变化和化学处理，使聚集体单链化并去除P1端的DNA链，只留下P2端的DNA单链。

　　· 边连接边测序：将带有荧光探针和可逆终止子的四种dNTPs逐一加入到FlowChip中，并利用DNA连接酶将它们连接到聚集体的DNA链上。每次只能加入一个碱基对，然后用激光激发荧光信号，并用CCD相机记录每个聚集体发出的荧光信号，从而确定碱基对序列。然后用化学剂去除荧光探针和可逆终止子，使下一个碱基对可以继续加入。重复这个过程，直到完成所有的测序循环。

　　· 数据分析：将CCD相机收集到的荧光信号转换为原始数据(BCL文件)，并进行质量控制和过滤，去除低质量的聚集体和信号。然后进行碱基识别(Base calling)，将荧光信号转换为碱基对序列(FASTQ文件)。最后根据不同的测序目的，进行后续的数据分析，如比对、变异检测、表达量计算等。

　　5.2. 主要组成

　　· 测序仪主机：包含电泳系统、自动进样系统、激光系统、光学系统、温控系统、聚合物输送系统等多个模块，用于控制仪器的运行和数据的采集。

　　· 计算机工作站：预装用于仪器控制、数据收集和样品文件自动分析的软件，如Data Collection Software、Sequencing Analysis Software等。

　　· FlowChip：是一个微型的玻璃芯片，它的表面覆盖了数百万个微孔，每个微孔可以容纳一个DNA捕获珠(DNA Capture Bead)，并进行单分子测序反应。

　　· DNA捕获珠(DNA Capture Bead)：是一种直径约28微米的磁性珠子，它的表面覆盖了数千个固定在不同位置的寡核苷酸探针，这些探针与文库DNA片段的接头互补，可以通过乳液PCR(Emulsion PCR)扩增形成单分子聚集体(Single Molecule Cluster)。

　　· 荧光探针(Fluorescent probe)：是指用于标记不同碱基对的四种荧光分子，它们分别对应A/T、T/A、C/G、G/C四种碱基对，并发出不同颜色的光。荧光探针还带有可逆终止子，可以控制每次只加入一个碱基对。

　　· 激光器(Laser)：是指用于激发荧光探针发光的光源，它可以提供单波长、固态、长寿命的激光光束。

　　· CCD相机(CCD camera)：是指用于捕捉和记录荧光信号的设备，它可以将荧光信号转换为数字化的电信号，并传输给计算机进行数据分析。

　　5.3. 主机组成

　　· 电泳系统：是指用于将带有荧光探针和可逆终止子的四种dNTPs逐一加入到FlowChip中，并利用DNA连接酶将它们连接到聚集体的DNA链上的系统。每次只能加入一个碱基对，然后用激光激发荧光信号，并用CCD相机记录每个聚集体发出的荧光信号，从而确定碱基对序列。

　　· 自动进样系统：是指用于将经过乳液PCR处理后的DNA捕获珠注入到FlowChip中，并使每个微孔中只有一个DNA捕获珠的系统。然后进行温度变化和化学处理，使聚集体单链化并去除P1端的DNA链，只留下P2端的DNA单链。

　　· 激光系统：是指用于激发荧光探针发光的光源，它可以提供单波长、固态、长寿命的激光光束。

　　· 光学系统：是指用于捕捉和记录荧光信号的设备，它可以将荧光信号转换为数字化的电信号，并传输给计算机进行数据分析。

　　· 温控系统：是指用于控制FlowChip板和反应液的温度，以保证测序反应的稳定性和效率的系统。

　　· 聚合物输送系统：是指用于将不同类型和浓度的聚合物溶液输送到FlowChip板中，以提供不同阶段所需的反应条件和试剂的系统。

　　6. Sequel II System

图源自PACB官网

　　Sequel II System测序仪是一种基于单分子实时测序(Single Molecule Real-Time Sequencing，SMRT)技术的三代测序平台，它可以提供高通量、高准确度和超长读长的DNA测序服务。

　　6.1. 相关原理

　　· 文库构建：将待测DNA打断成小片段，并在两端加上特殊的接头(Adaptor)，这些接头包含用于测序引物结合的序列(P1/P2)。文库构建后需要进行质量检测和定量。

　　· SMRT Cell装载：将文库DNA片段与DNA聚合酶混合，并注入到SMRT Cell中，并使每个微孔中只有一个DNA聚合酶。然后进行温度变化和化学处理，使文库DNA片段与测序引物结合，并形成环状结构。

　　· 边合成边测序：将带有荧光核苷酸的四种dNTPs逐一加入到SMRT Cell中，并利用DNA聚合酶将它们连接到环状DNA链上。每次只能加入一个碱基，然后用激光激发荧光信号，并用CCD相机记录每个微孔发出的荧光信号，从而确定碱基序列。然后用化学剂去除环状DNA链上的碱基，使下一个碱基可以继续加入。重复这个过程，直到完成所有的测序循环。

　　· 数据分析：将CCD相机收集到的荧光信号转换为原始数据(BAM文件)，并进行质量控制和过滤，去除低质量的信号。然后进行碱基识别(Base calling)，将荧光信号转换为碱基序列(FASTQ文件)。最后根据不同的测序目的，进行后续的数据分析，如比对、变异检测、表达量计算等。

　　6.2. 主要组成

　　· 测序仪主机：包含电泳系统、自动进样系统、激光系统、光学系统、温控系统、聚合物输送系统等多个模块，用于控制仪器的运行和数据的采集。

　　· 计算机工作站：预装用于仪器控制、数据收集和样品文件自动分析的软件，如Data Collection Software、Sequencing Analysis Software等。

　　· SMRT Cell 8M：是一个微型的玻璃芯片，它的表面覆盖了数百万个微孔，每个微孔可以容纳一个DNA聚合酶(DNA Polymerase)，并进行单分子测序反应。

　　· 荧光核苷酸(Fluorescent nucleotide)：是指用于标记不同碱基的四种荧光分子，它们分别对应A、T、C、G四种碱基，并发出不同颜色的光。荧光核苷酸在被DNA聚合酶催化加入到DNA链上时，会释放出荧光信号，并被去除。

　　· 激光器(Laser)：是指用于激发荧光核苷酸发光的光源，它可以提供单波长、固态、长寿命的激光光束。

　　· CCD相机(CCD camera)：是指用于捕捉和记录荧光信号的设备，它可以将荧光信号转换为数字化的电信号，并传输给计算机进行数据分析。

　　6.3. 主机组成

　　· 电泳系统：是指用于将带有荧光核苷酸的四种dNTPs逐一加入到SMRT Cell中，并利用DNA聚合酶将它们连接到环状DNA链上的系统。每次只能加入一个碱基，然后用激光激发荧光信号，并用CCD相机记录每个微孔发出的荧光信号，从而确定碱基序列。

　　· 自动进样系统：是指用于将文库DNA片段与DNA聚合酶混合，并注入到SMRT Cell中，并使每个微孔中只有一个DNA聚合酶的系统。然后进行温度变化和化学处理，使文库DNA片段与测序引物结合，并形成环状结构。

　　· 激光系统：是指用于激发荧光核苷酸发光的光源，它可以提供单波长、固态、长寿命的激光光束。

　　· 光学系统：是指用于捕捉和记录荧光信号的设备，它可以将荧光信号转换为数字化的电信号，并传输给计算机进行数据分析。

　　· 温控系统：是指用于控制SMRT Cell板和反应液的温度，以保证测序反应的稳定性和效率的系统。

　　· 聚合物输送系统：是指用于将不同类型和浓度的聚合物溶液输送到SMRT Cell板中，以提供不同阶段所需的反应条件和试剂的系统。

　　7. MinION Device

图源自Oxford官网

　　MinION Device测序仪是一种基于单分子实时测序(Single Molecule Real-Time Sequencing，SMRT)技术的三代测序平台，它可以提供高通量、高准确度和超长读长的DNA和RNA测序服务。

　　7.1. 相关原理

　　· 文库构建：将待测DNA或RNA打断成小片段，并在两端加上特殊的接头(Adaptor)，这些接头包含用于测序引物结合的序列(P1/P2)。文库构建后需要进行质量检测和定量。

　　· SMRT Cell装载：将文库片段与DNA聚合酶混合，并注入到SMRT Cell中，并使每个微孔中只有一个DNA聚合酶。然后进行温度变化和化学处理，使文库片段与测序引物结合，并形成环状结构。

　　· 边合成边测序：将带有荧光核苷酸的四种dNTPs逐一加入到SMRT Cell中，并利用DNA聚合酶将它们连接到环状DNA链上。每次只能加入一个碱基，然后用激光激发荧光信号，并用CCD相机记录每个微孔发出的荧光信号，从而确定碱基序列。然后用化学剂去除环状DNA链上的碱基，使下一个碱基可以继续加入。重复这个过程，直到完成所有的测序循环。

　　· 数据分析：将CCD相机收集到的荧光信号转换为原始数据(FAST5文件)，并进行质量控制和过滤，去除低质量的信号。然后进行碱基识别(Base calling)，将荧光信号转换为碱基序列(FASTQ文件)。最后根据不同的测序目的，进行后续的数据分析，如比对、变异检测、表达量计算等。

　　7.2. 主要组成

　　· 测序仪主机：是一个小巧的USB设备，它可以连接到任何电脑或笔记本，并通过软件进行控制和数据传输。

　　· SMRT Cell：是一个微型的塑料芯片，它的表面覆盖了数千个微孔，每个微孔可以容纳一个DNA聚合酶(DNA Polymerase)，并进行单分子测序反应。

　　· 荧光核苷酸(Fluorescent nucleotide)：是指用于标记不同碱基的四种荧光分子，它们分别对应A、T、C、G四种碱基，并发出不同颜色的光。荧光核苷酸在被DNA聚合酶催化加入到DNA链上时，会释放出荧光信号，并被去除。

　　· 激光器(Laser)：是指用于激发荧光核苷酸发光的光源，它可以提供单波长、固态、长寿命的激光光束。

　　· CCD相机(CCD camera)：是指用于捕捉和记录荧光信号的设备，它可以将荧光信号转换为数字化的电信号，并传输给电脑进行数据分析。

　　7.3. 主机组成

　　· 电泳系统：是指用于将带有荧光核苷酸的四种dNTPs逐一加入到SMRT Cell中，并利用DNA聚合酶将它们连接到环状DNA链上的系统。每次只能加入一个碱基，然后用激光激发荧光信号，并用CCD相机记录每个微孔发出的荧光信号，从而确定碱基序列。

　　· 自动进样系统：是指用于将文库片段与DNA聚合酶混合，并注入到SMRT Cell中，并使每个微孔中只有一个DNA聚合酶的系统。然后进行温度变化和化学处理，使文库片段与测序引物结合，并形成环状结构。

　　· 激光系统：是指用于激发荧光核苷酸发光的光源，它可以提供单波长、固态、长寿命的激光光束。

　　· 光学系统：是指用于捕捉和记录荧光信号的设备，它可以将荧光信号转换为数字化的电信号，并传输给电脑进行数据分析。

　　8. HeliScope Single Molecule Sequencer

　　HeliScope Single Molecule Sequencer测序仪是一种基于荧光测序原理的单分子测序平台，它可以直接对DNA进行测序，无需进行PCR扩增或文库构建。

　　8.1. 相关原理

　　· 文库准备：将待测DNA打断成小片段，并在每个小片段(约200bp)的末端加上poly-A尾。

　　· 芯片装载：将文库DNA片段与固定在芯片上的poly-T引物进行杂交，并精确定位，使每个微孔中只有一个DNA模板。

　　· 边合成边测序：将带有荧光探针和可逆终止子的四种dNTPs逐一加入到芯片中，并利用DNA聚合酶将它们连接到DNA链上。每次只能加入一个碱基对，然后用激光激发荧光信号，并用CCD相机记录每个微孔发出的荧光信号，从而确定碱基对序列。然后用化学剂去除荧光探针和可逆终止子，使下一个碱基对可以继续加入。重复这个过程，直到完成所有的测序循环。

　　· 数据分析：将CCD相机收集到的荧光信号转换为原始数据(BCL文件)，并进行质量控制和过滤，去除低质量的信号。然后进行碱基识别(Base calling)，将荧光信号转换为碱基对序列(FASTQ文件)。最后根据不同的测序目的，进行后续的数据分析，如比对、变异检测、表达量计算等。

图源自portorford.info|

　　8.2. 主要组成

　　· 测序仪主机：是一个大型的设备，它可以连接到电脑或服务器，并通过软件进行控制和数据传输。

　　· 测序芯片：是一个微型的玻璃芯片，它的表面覆盖了数亿个微孔，每个微孔可以容纳一个DNA模板，并进行单分子测序反应。

　　· 荧光探针：是指用于标记不同碱基的四种荧光分子，它们分别对应A、T、C、G四种碱基，并发出不同颜色的光。荧光探针在被DNA聚合酶催化加入到DNA链上时，会释放出荧光信号，并被去除。

　　· 激光器：是指用于激发荧光探针发光的光源，它可以提供单波长、固态、长寿命的激光光束。

　　· CCD相机：是指用于捕捉和记录荧光信号的设备，它可以将荧光信号转换为数字化的电信号，并传输给电脑进行数据分析。

　　二. 测序原理和发展

　　· 测序技术的概念和原理：介绍什么是测序技术，它是如何工作的，以及它的主要分类和特点 。

　　· 测序技术的发展历史：回顾测序技术的发展过程，从第一代测序技术(如Sanger法)到第二代测序技术(如Illumina法)再到第三代测序技术(如Nanopore法) 。

　　· 测序技术的应用领域：介绍测序技术在生命科学中的各种应用，如基因组学、转录组学、表观遗传学、微生物组学、个体化医疗等 。

　　· 测序技术的挑战和未来：分析测序技术面临的主要挑战，如数据量、数据质量、数据分析、数据存储、数据共享等 ，以及展望测序技术的未来发展方向和趋势 。

　　1. 基本概念

　　· 读长(read length)：读长是指测序得到的DNA片段的长度，一般来说，读长越长，越有利于拼接基因组和发现结构变异。在这方面，三代测序技术(如Nanopore和PacBio)具有明显的优势，它们可以测定长达数十kb甚至Mb级别的读长，而二代测序技术(如Illumina和Roche 454)的读长一般在数百bp到数千bp之间，Helicos的读长则最短，只有25-50bp。

　　· 准确度(accuracy)：准确度是指测序结果与真实DNA序列的一致性，一般用错误率来衡量。

　　· 通量(throughput)：通量是指测序平台每次运行可以产生的数据量，一般用Gbp或Tbp来表示。

　　· 成本(cost)：成本是指进行测序所需的费用，包括仪器、试剂、人工、时间等因素。

　　2. 技术的选择

　　“如何选择合适的测序技术”这是一个很重要的问题，因为不同的测序技术有不同的特点和适用范围。一般来说，选择测序技术需要考虑以下几个因素：

　　· 测序目的：你想要测定什么样的DNA或RNA?是基因组、转录组、表观遗传组、微生物组还是其他?你想要了解什么样的信息?是序列变异、基因表达、基因调控、基因功能还是其他?

　　· 测序需求：你需要多少数据量来达到你的测序目的?你需要多高的准确度和重复性来保证你的测序质量?你需要多长的读长来覆盖你的目标区域?

　　· 测序资源：你有多少样品可以进行测序?你的样品质量和数量如何?你有多少时间和预算可以用于测序?

　　根据这些因素，你可以对比不同的测序技术的优缺点，选择最适合你的测序方案。

　　· 如果你想要测定全基因组或全转录组，并且对数据量和成本有较高的要求，那么你可以选择Illumina或Roche 454等二代测序技术，它们可以提供高通量和低成本的测序服务。

　　· 如果你想要测定特定的基因或区域，并且对准确度和重复性有较高的要求，那么你可以选择Sanger法等一代测序技术，它们可以提供高准确度和高重复性的测序服务。

　　· 如果你想要测定长片段或结构变异，并且对读长和拼接有较高的要求，那么你可以选择Nanopore或PacBio等三代测序技术，它们可以提供超长读长和单分子测序的服务。

　　3. 概念和原理

　　测序技术是指获得目的核酸分子(DNA或RNA)碱基排列顺序的技术，它是生命科学研究的基础和核心。测序技术的原理是利用不同的方法对目的核酸分子进行合成、标记、检测和识别，从而确定其碱基序列。

　　测序技术可以根据其使用的方法和原理分为不同的代数和类型，主要有以下几种：

　　· 第一代测序技术：是指最早出现的基于荧光测序原理的测序技术，如Sanger法和Maxam-Gilbert法，它们通过使用特殊的链终止核苷酸或化学降解剂来中断DNA合成反应，并通过凝胶电泳和放射自显影来检测荧光信号，从而确定碱基序列。Sanger法是基于DNA聚合酶在体外DNA复制过程中随机掺入终止链延伸的双脱氧核苷酸(ddNTPs)的原理。这些ddNTPs可以用放射性或荧光标记来检测，从而得到DNA的碱基序列。Sanger法由英国生物化学家弗雷德里克·桑格于1977年发明，是第一代DNA测序技术，曾被广泛用于人类基因组计划等大规模的基因组分析。

　　· 第二代测序技术：是指基于高通量测序原理的测序技术，如Illumina法、Roche 454法、ABI SOLiD法等，它们通过使用特殊的接头、引物、荧光探针等来对目的核酸分子进行扩增、标记和检测，并通过芯片或微珠等平台来实现大规模并行测序，从而大大提高了测序速度和通量。

　　o Roche 454技术：这是一种基于焦磷酸测序法的技术，它利用喷雾法将DNA打断成小片段，并在两端加上接头。然后将这些片段结合在微珠上，并在乳液PCR中进行扩增。最后将这些微珠放入一个含有许多小孔的反应板中，每个小孔只容纳一个微珠。在测序过程中，每次加入一种dNTP，并检测每个小孔中是否发生了焦磷酸释放反应，从而确定碱基序列。

　　o Illumina/Solexa技术：这是一种基于桥式PCR和荧光检测的技术，它也是目前最流行的测序技术之一。它将DNA打断成小片段，并在两端加上接头。然后将这些片段吸附在流动槽(flowcell)的表面，并进行桥式PCR扩增，形成聚集体(cluster)。在测序过程中，每次加入四种带有不同荧光标记的dNTP，并利用激光和相机记录每个聚集体发出的荧光信号，从而确定碱基序列。

　　o ABI SOLiD技术：这是一种基于连接酶和荧光检测的技术，它与Illumina技术类似，也是将DNA打断成小片段，并在两端加上接头。然后将这些片段结合在微珠上，并在乳液PCR中进行扩增。最后将这些微珠固定在玻璃滑片上，形成聚集体。在测序过程中，每次加入四种带有不同荧光标记的二聚体(如AA,AC,AG,AT等)，并利用连接酶将它们连接到模板链上。然后利用激光和相机记录每个聚集体发出的荧光信号，从而确定碱基序列。

　　· 第三代测序技术：是指基于单分子实时测序原理的测序技术，可以直接测定单分子的DNA或RNA的测序方法，不需要进行PCR扩增，从而减少错误和偏差，并且可以获得更长的读长(read length)。如Nanopore法、PacBio法、Helicos法等，它们通过使用特殊的微孔、DNA聚合酶、荧光探针等来对单个核酸分子进行直接测序，无需进行扩增或文库构建，并通过电信号或光信号来检测碱基加入的过程，从而获得超长读长和高准确度的碱基序列。

　　o PacBio公司的单分子实时测序技术(SMRT)，它是基于DNA聚合酶在体外DNA复制过程中随机掺入带有荧光标记的dNTPs的原理。这些dNTPs可以用激光和相机检测，从而得到DNA的碱基序列。PacBio的优点是可以测定长达数十kb的读长，以及检测一些碱基修饰情况，如甲基化等。PacBio的缺点是测序错误率较高(约10-15%)，主要为随机的插入和缺失错误，但可以通过多次测序和自身校正来提高准确度。

　　o Oxford Nanopore公司的单分子纳米孔测序技术(Nanopore)，它是基于电信号检测原理，当DNA分子穿过纳米孔时会产生电流信号，一般以5个碱基为一组检测电流信号，对电流信号进行解码。Nanopore的优点是可以测定超长的读长，最长可达Mb级别，以及便携性和实时性。Nanopore的缺点是测序错误率也较高(约10-15%)，主要为同聚物和串联重复区域的错误，以及反向重复序列对测序质量的影响。

　　o Helicos公司的真正单分子测序技术(tSMS)，它是基于荧光检测原理，将DNA打断成小片段，在每个小片段的末端加上poly-dA，并于玻璃芯片上随机固定多个poly-dT引物。然后逐一加入带有荧光标记和终止子的dNTPs，并利用显微镜记录每个小片段发出的荧光信号，从而确定碱基序列。Helicos的优点是可以避免PCR扩增带来的偏差，以及对样品量和纯度要求低。Helicos的缺点是测序错误率最高(约20-30%)，主要为缺失错误，以及同聚物对测序质量的影响。

　　4. 发展历史

　　测序技术的发展历史可以追溯到1975年，当时Frederick Sanger提出了链终止法，并用它成功地测定了噬菌体φX174的基因组序列(5375个碱基)，这是人类历史上第一个完整的基因组图谱。

　　1977年，Walter Gilbert提出了链降解法，并用它成功地测定了噬菌体MS2的基因组序列(3569个碱基)。

　　1980年，Sanger和Gilbert因为在测序技术方面的贡献而共同获得了诺贝尔化学奖。

　　1986年，Leroy Hood等人发明了第一台自动化荧光测序仪，并用它成功地完成了人类线粒体DNA(16569个碱基)的全长测序。

　　1990年，人类基因组计划正式启动，目标是在15年内完成人类全基因组(约30亿个碱基)的测定。

　　1995年，Craig Venter等人利用全基因组随机打断法(Whole Genome Shotgun Method)首次完成了一种自由生活细菌——溶血性链球菌的全基因组测序(180万个碱基)。

　　1996年，Roche公司收购了454 Life Sciences公司，并开始开发基于焦磷酸测序法(Pyrosequencing)的高通量测序技术。

　　1998年，ABI公司推出了第一台基于荧光原位合成法(Fluorescence In Situ Sequencing，FISSEQ)的高通量测序仪——ABI 3700 Genetic Analyzer。

　　2001年，人类基因组计划和Celera Genomics公司分别公布了人类基因组的初步草图，标志着人类基因组计划的完成。

　　2005年，Solexa公司推出了第一台基于桥式扩增法(Bridge Amplification)和可逆终止法(Reversible Terminator)的高通量测序仪——Solexa 1G Genome Analyzer。

　　2006年，Illumina公司收购了Solexa公司，并开始开发基于桥式扩增法和可逆终止法的高通量测序技术。

　　2007年，Roche 454公司推出了第一台基于乳胶珠扩增法(Emulsion PCR)和焦磷酸测序法的高通量测序仪——Roche 454 GS FLX。

　　2008年，ABI公司推出了第一台基于乳胶珠扩增法和荧光连接法(Ligation Sequencing)的高通量测序仪——ABI SOLiD System。

　　2009年，Helicos Biosciences公司推出了第一台基于单分子荧光测序法(Single Molecule Fluorescent Sequencing)的单分子测序仪——HeliScope Single Molecule Sequencer。

　　2010年，Pacific Biosciences公司推出了第一台基于单分子实时测序法(Single Molecule Real-Time Sequencing，SMRT)的单分子测序仪——PacBio RS。

　　2011年，Ion Torrent公司推出了第一台基于半导体测序法(Semiconductor Sequencing)的高通量测序仪——Ion Torrent PGM。

　　2012年，Oxford Nanopore Technologies公司推出了第一台基于纳米孔测序法(Nanopore Sequencing)的单分子测序仪——MinION Device。

　　2015年，BGI公司推出了第一台基于芯片化荧光测序法(Chip-based Fluorescent Sequencing)的高通量测序仪——BGISeq-500。

　　2017年，10x Genomics公司推出了第一台基于连线染色体构象捕获技术(Linked-Reads Technology)的高通量测序仪——Chromium Genome System。

　　至此，从第一代到第三代的各种测序技术已经形成了一个多样化、竞争性和互补性的生态系统，为生命科学研究提供了丰富而强大的工具。

　　2018年到2023年最近5年测序技术的发展：

　　· 测序技术的创新和优化：在这段时间内，各种测序技术都在不断地进行创新和优化，以提高测序的速度、准确度、通量、成本效益等方面的性能。例如，Illumina公司推出了NovaSeq系列测序仪，可以实现每天测序6000个人类基因组;PacBio公司推出了Sequel II和Sequel IIe测序仪，可以实现每次测序8Tb的数据和平均读长20kb;Oxford Nanopore公司推出了PromethION和GridION测序仪，可以实现每次测序100Tb的数据和平均读长30kb;Ion Torrent公司推出了Genexus集成化测序系统，可以实现24小时内完成从样本到报告的全流程;10x Genomics公司推出了Chromium X系列测序仪，可以实现每次测序1.2Tb的数据和平均读长150kb;BGI公司推出了DNBSEQ-T7和DNBSEQ-G400测序仪，可以实现每次测序6Tb和400Gb的数据和平均读长100bp。

　　· 测序技术的多样化和互补性：在这段时间内，各种测序技术都在不断地扩展其应用范围和领域，以满足不同的研究需求和目标。例如，Illumina公司推出了TruSeq Nano DNA Library Prep Kit，可以实现从低至100ng的DNA样本进行全基因组测序;PacBio公司推出了HiFi Reads技术，可以实现单分子测序的高准确度(>99%);Oxford Nanopore公司推出了LamPORE技术，可以实现从RNA直接进行SARS-CoV-2病毒检测;Ion Torrent公司推出了Oncomine Precision Assay，可以实现从肿瘤组织或血液样本进行癌症基因检测;10x Genomics公司推出了Visium Spatial Gene Expression Solution，可以实现从组织切片进行空间转录组测序;华大智造推出DNBelab C系列高通量文库制备试剂盒，自动化文库制备系统，节省人力物力，提高通量，减少操作失误。

　　· 测序技术的应用和赋能：在这段时间内，各种测序技术都在不断地应用于各个领域和行业，以促进科学发现和社会进步。例如，在基因组学领域，完成了人类基因组计划第二阶段(HGP-write)的启动、人类细胞图谱计划(Human Cell Atlas)的进展、人类变异图谱计划(Human Variome Project)的更新等重大项目;在转录组学领域，完成了人类脑转录组计划(BRAIN Initiative)的初步结果、人类免疫细胞转录组计划(Human Immunome Project)的部分结果、人类肠道菌群转录组计划(Human Gut Microbiome Project)的部分结果等重要研究;在表观遗传学领域，完成了人类表观组计划(Human Epigenome Project)的部分结果、人类表观组图谱计划(Human Epigenome Atlas)的部分结果、人类表观组变异计划(Human Epigenome Variation Project)的部分结果等关键研究;在微生物组学领域，完成了地球微生物组计划(Earth Microbiome Project)的部分结果、人类口腔微生物组计划(Human Oral Microbiome Project)的部分结果、人类皮肤微生物组计划(Human Skin Microbiome Project)的部分结果等重要研究;在个体化医疗领域，完成了百万人基因组计划(Million Genomes Project)的部分结果、百万人精准医疗计划(Million Precision Medicine Project)的部分结果、百万人癌症基因组计划(Million Cancer Genomes Project)的部分结果等重大项目。

　　5. 应用领域

　　o 基因组学：是指研究生物体所有遗传信息及其功能、结构、表达、变异、进化等方面的学科，它依赖于测序技术来获取基因组序列和注释，以及进行基因组比较、基因组变异、基因组编辑等研究。

　　o 转录组学：是指研究生物体在特定条件下所有转录本的类型、数量、结构、功能和相互作用的学科，它依赖于测序技术来获取转录本序列和表达量，以及进行转录本组装、差异表达分析、可变剪接分析、非编码RNA分析等研究。

　　o 表观遗传学：是指研究生物体在不改变DNA序列的情况下，通过化学修饰或染色质重塑等方式调控基因表达的学科，它依赖于测序技术来获取DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质可及性等信息，以及进行表观遗传标记分布、表观遗传变异、表观遗传调控等研究。

　　o 微生物组学：是指研究特定环境或宿主中所有微生物的种类、数量、功能和相互作用的学科，它依赖于测序技术来获取微生物的16S rRNA或全基因组序列，以及进行微生物分类鉴定、微生物群落结构、微生物功能分析等研究。

　　o 个体化医疗：是指根据个人的基因组、转录组、蛋白质组等信息，为其提供最适合的预防、诊断和治疗方案的医疗模式，它依赖于测序技术来获取个人的遗传变异和表达谱，以及进行个人风险评估、个人药物反应预测、个人靶向治疗选择等应用。

　　6. 挑战和未来

　　测序技术虽然已经取得了巨大的进步和成就，但仍然面临着一些挑战和问题，主要包括：

　　· 数据量：随着测序技术的发展，测序数据的产生速度远远超过了数据存储和处理的能力，导致数据管理和分析成为一个瓶颈。

　　· 数据质量：不同的测序技术有着不同的数据质量特征，如读长、准确度、偏好性等，这些特征会影响数据分析的结果和可靠性。

　　· 数据分析：测序数据的分析涉及到多种复杂的算法和工具，如比对、组装、注释、变异检测等，这些算法和工具需要不断地优化和更新，以适应不同的数据类型和需求。

　　· 数据存储：测序数据的存储需要占用大量的硬件资源和空间，同时也需要考虑数据的安全性和可访问性。

　　· 数据共享：测序数据的共享需要解决数据的标准化、元数据、伦理、法律等方面的问题，同时也需要建立有效的数据交换和利用的机制和平台。

　　测序技术的未来发展方向和趋势主要包括：

　　· 数据集成：通过将不同来源、不同层次、不同类型的测序数据进行整合和融合，以提高数据的信息量和价值。

　　· 数据挖掘：通过运用机器学习、人工智能等先进的技术和方法，对测序数据进行深入的分析和挖掘，以发现数据中隐藏的规律和知识。

　　· 数据应用：通过将测序数据与其他领域的数据进行关联和对比，以拓展测序数据的应用范围和意义。

　　· 数据创新：通过开发新的测序技术和平台，以提高测序数据的质量和效率，以及实现新的测序功能和目标。