NGS Q40是终点吗？SBB测序数据作了“回答”

基因测序仪是解码生命科学的利器，因其技术壁垒高、开发难度大，市场长期被少数几家跨国企业垄断。近些年，基因测序仪市场格局正在快速发生变化，涌现出许多新企业并纷纷推出自主研发的商品化测序仪。

基于此，仪器信息网特别策划“ 基因测序仪新势力” (点击查看约稿详情 ）专题，并向测序技术研究专家、测序仪应用专家和基因测序仪企业广泛约稿（欢迎大家投稿，投稿邮箱：lizk@instrument.com.cn），充分了解基因测序新企业、新仪器、新技术及新应用进展。本篇为PacBio供稿。

PacBio是一家生物技术公司，全称是Pacific Biosciences of California，成立于2004年，总部位于美国加利福尼亚州门洛帕克 (Ienlo Park)。PacBio核心技术是第三代单分子实时DNA测序技术；2021年收购Omniome，随后开始开发高度差异化短读台式测序仪；2022年10月，PacBio推出高精度短读长测序平台Onso；今年第二季度，Onso平台开始发货，近日，亚太首套Onso落地基因集团紫竹高新区测序实验室。下面跟随本篇内容，详细了解PacBio高精度短读长测序平台Onso。

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与近年来长读长测序技术的重大进步相比，传统短读长测序的核心边合成边测序 (SBS) 化学成分几乎没有发生任何变化。因此，许多研究计划和方法都受到这种旧技术的基础化学所造成的准确性限制。然而，PacBio 通过其独特的边结合边测序 (SBB)  技术核心的革命性新化学物质有能力彻底颠覆这些限制。

什么是SBB测序？

SBB 测序是一种 Q40+ 短读长测序技术，其工作原理是测量荧光标记的核苷酸与 DNA 链上的聚合酶结合（但未掺入）时发出的荧光信号。然后计算机将这些光信号与相应的核苷酸碱基识别相匹配。与其他短读长技术不同，SBB 将测序过程中的结合步骤和后续延伸步骤分开，从而消除了分子疤痕引入的错误。

SBB测序也是由 DNA 链上的聚合酶启动，并在 3' 端带有可逆阻断剂，以防止其他碱基完全掺入这条不断增长的链中（步骤 1）。然后，在碱基识别阶段，荧光标记的碱基充满流动池。与传统的 SBS 测序不同，这些标记碱基不包含阻断剂。一旦适当的标记碱基与 DNA 链结合，就会发出荧光信号，并使用强大的光学器件进行测量（步骤 2）。与 SBS 测序的一个关键区别是，这种标记的核苷酸碱基不会并入 DNA 链中，而是在测序仪器捕获碱基信号后被洗掉。此后，通过去除可逆阻断剂来激活核苷酸的 3' 末端（步骤 3）。这确保了从充满流动池的未标记、封闭的核苷酸中掺入适当的碱基，从而阻止额外的掺入，直到下一个循环的适当时间为止（步骤 4）。

Onso是PacBio推出的短读长测序平台

PacBio基于SBB技术开发了Onso 短读长测序系统。它是一个可扩展且灵活的台式测序平台，通过其独特的SBB技术提供非凡的准确性。 Onso 系统具有较低的测序噪音，使研究人员能够以较低的测序深度就能发现以前遗漏的罕见变异。 Onso 系统提供的准确性将有助于推动微小残留病灶液体活检测试（MRD）、微生物群落抗生素耐药性监测、基因编辑实验中的脱靶分析以及许多其他需要高灵敏度测序的应用。

由于SBB 测序在测序周期的每个阶段都使用优化的条件，所以相对于SBS测序，Onso平台拥有：

极少的重复reads

除了避免分子疤痕造成的测序错误累积之外，PacBio SBB测序的重复率比传统的短读长技术低得多。与重叠的读数不同，重复的序列不会为分析添加额外的信息价值，并且通常通过生物信息学在称为去重的过程中被过滤。由于 SBB 测序产生的冗余序列较少，因此重复数据过滤过程所浪费的数据和计算资源较少，从而使整体分析更加简化。

极少的标签跳跃

传统 SBS 测序使用的图案化流动池的扩增方法可能会导致部分独特索引在测序过程中在样品池之间交叉。这会导致数据中的噪声增加，这是由于一个样本的reads被错误地分配给另一个样本而引起的，而SBB测序不存在这个问题。

更高水平的准确性

通过消除分子疤痕、减少重复并最大限度地减少标签跳跃，SBB 测序可提供非凡的读取准确性，其错误率仅为万分之一或更少 (Q40+)，这是前所未有的。

Q40是不是终点？

来自Weill Cornell医学院的Chris Mason 博士说：“我们看到了Onso令人印象深刻的数据质量，远高于 Q30 的行业标准。我们已经进行了几次原始质量得分超过 Q50 的运行，这是我从未见过的情况。我们看到 Onso 的性能为医学研究和转化医学应用开辟了新的可能性，在这些应用中，准确性是成功的关键。”

事实上，当使用改进的文库构建试剂和流程后，SBB测序能够达到Q50+水平的准确率。

Onso测序平台参数