开菲尔乳杆菌的培养方法与实验内容及打管说明！

                  开菲尔乳杆菌的培养方法与实验内容及打管说明！

一、菌种简介

平台编号：Bio-53103

规格：冻干物

拉丁属名：Lactobacillus Kefiri

菌株名称：开菲尔乳杆菌

其他编号：DSM20587=ATCC35411

培养基编号：58

培养温度：34－37

培养时间：48 小时

用途：模式菌株

用途：模式菌株

注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用（产品信息以出库为准）

二、培养基

MRS 培养基

酪蛋白胨 10 克 牛肉浸取物 10 克

酵母提取液 5.0 克 葡萄糖 20 克

乙酸钠 5.0 克 柠檬酸二胺 2.0 克

吐温 80 1.0 克 磷酸氢二钾 2.0 克

七水硫酸镁 0.2 克 七水硫酸锰 0.05 克

碳酸钙 20.0 克 琼脂 20.0 克

蒸馏水 1.0 升 PH 6.8

如果要配制液体培养基，则不用加入碳酸钙和琼脂

三、培养方法

1、菌种是指食用菌菌丝体及其生长基质组成的繁殖材料。菌种分为母种（一级种）、原种（二级种）和栽培种（三级种）三级。工业发酵的有用菌种，其筛选步骤包括菌种分离、初筛和复筛。

2、挑选具有某种能力的有用菌种，也称种子制备，是指菌种在一定条件下，经过扩大培养成为具有一定数量和质量的纯生产菌种的制备过程。以作接入发酵罐中进一步扩大菌体量及合成产物之用。

3、种子制备包括孢子制备和菌丝体制备菌种制备。

4、保存在沙土管或冷冻管中的生产菌种，用无菌手续挑取少许，接入琼脂斜面培养基上，在25（或较高温度）下培养5～7天（或较长时间。所得孢子还需进一步用较大表面积的固体培养基以获得更多孢子（对于霉菌类孢子制备，多数采用大米、小米之类的天然培养基）。

5、将培养成熟的斜面孢子制成悬浮液，接种到扁瓶固体培养基上，于25～28培养14天。将成熟的扁瓶孢子于真空中抽干，使水分降至10%以下，并放入 4冰箱中备用。一次制得的孢子瓶可在生产上延续使用半年左右。

6、如果有些生产菌种不产孢子，如赤霉素产生菌或产孢子不多的，则可采用摇瓶液体培养制得菌丝体，作种子罐的种子。种子罐的目的是使接入有限的孢子或菌丝体迅速发芽、生长、繁殖成大量菌体。其中的培养基组分应是易于被菌体利用的碳源（如葡萄糖）和氮源（如玉米浆），及无机盐(如磷酸盐)等。作为发酵罐的种子应生命力旺盛、染色深、菌丝粗壮，无杂菌及异常菌体。接种量一般在10%～20%。

四、实验内容

1、称量→溶化→调pH→过滤→分装→加塞→包扎→灭菌→无菌检查

2、干热灭菌：装入待灭菌物品→升温→恒温→降温→开箱取物

3、高压蒸汽灭菌：加水→装物品→加盖→加热→排冷空气→加压→恒压→降压回零→排汽→取物→无菌检查

4、过滤除菌：组装灭菌→连接→压滤→无菌检查→清洗灭菌

五、保藏条件

斜面菌种和冻干菌种应在 2-8°C 保存。西林瓶请在-20°C 保存。

六、注意事项

1）冻干首次活化，干粉要全部用完，不能预留，用无菌吸管吸取 0.3ml 的培养液（即以上建议的培养基配方，不加琼脂）或者无菌水，滴入冻干管中，轻轻振荡至其溶解。吸取全部菌悬液，接种在培养基上（建议不超过 2 支斜面或平板；若直接接种液体培养基，则试管液体以不超过 5ml 为宜）； 经过冷冻干燥保藏，菌种处于休眠状态，复苏培养时可能会延迟生长，这时需较长的培养时间； 若您收到的是已复苏的培养物（非冻干菌），则可以直接用于您的实验，或根据需要转接培养；如有不明白之处，请务必先咨询我单位技术人员，避免不必要的损失；

2）微生物菌种应保藏于低温、清洁干燥的地方，室温放置时间过长会导致菌种衰退；

3）菌种操作应在无菌条件下进行；转种完毕，应经灭菌再做丢弃处理；

4）应根据菌种状况及时转接，冻干菌种保藏时间通常为 2-25 年；

5）菌种使用过程中如出现杂菌污染或菌种生产性能下降，应及时和微生物菌种查询网联系。

6）如若有菌种复苏不活或者污染等情况，请在收到后 2 个月内联系，逾期不予受理；

7）打管操作需由专业微生物技术人员在相应的防护设备中进行，生物危害程度为三类的菌种应在生物安全柜中操作，打管时冻干管应远离面部，保护眼睛。

8）西林瓶开封：用 75%酒精棉擦拭西林瓶外部，在安全柜内使用尖嘴钳去除塑料盖及铝盖，注意不要同时打开胶塞。缓慢开启胶塞，用 75%酒精棉消毒瓶口部分，使用无菌吸管注入0.5ml 适宜的液体培养基复溶冻干粉末。

9）安瓿瓶开封：用浸过 75％酒精的脱脂棉擦净安瓿管，用火焰加热其顶端，滴少量（2-3滴）无菌水至加热顶端使之破裂，用锉刀或者镊子敲下已破裂的安瓿管顶端并将冻干管开口处在火焰上过一遍，并保持在火焰旁操作。

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