【飞诺美色谱】婴幼儿奶粉中双氰胺的检测 HPLC-UV 法和 LC-MS/MS 法

1.样品：新西兰 婴儿配方奶粉 (0~6 个月)

2.样品提取及净化
称取 1 g 试样于 50 mL 具塞离心管中，加 2 mL 水， 涡旋 30s，加 2 mL 乙腈涡旋 30s。再往现有的提取液中加 2 mL 乙腈，重复上述提取步骤。再将该提取步骤重复2次， 得到共计约 10 mL 的提取液。以 4000 r/min 离心 5 min， 将全部上清液加入新一代 Cleanert® MAS-QuChERS 管中(500mg / 15mL)，将 MAS 管上下晃动 30s，然后涡旋 30s 后，8000r/min 离心 5 min，取全部上清液 (约10 mL)于玻璃试管中，50℃ 下氮气吹干，加入 1 mL 乙腈-水混合溶液(97：3)复溶，过 0.22 µm 滤器，待测。
注：a. 做基质加标实验时的标准溶液建议选择以水为溶剂，防止加标瞬间发生蛋白沉淀；b.乙腈提取分 4 次，为防止乙腈体积过多时沉淀蛋白速度过快，影响提取效果；c. 净化液氮气吹干后， 如发现有少量油脂，可采用 1 mL 乙腈：水(97：3)混合溶液复溶，之后加入 1 mL 正己烷(色谱纯)液液萃取，取下层溶液过 0.22 μm 微孔滤膜，进样检测。

3.检测方法

3.1高效液相色谱法
色谱柱：Venusil® HILIC(5µm，100Å，4.6×250mm)；

流动相： 10mmol/L乙酸铵(pH=4.0)：乙腈=3：97；

波长：220nm；进样量：10µL；柱温：30℃；
流速：0.8mL/min。
注： 本实验选用的奶粉经过净化后， 按 10 mmol/ L 乙酸铵(pH=4.0)：乙腈=15：85 液相条件，有一个杂质与双氰胺完全重合，经实验条件优化后，确定流动相条件为 10 mmol/L 乙酸铵(pH=4.0)：乙腈=3：97，双氰胺保留时间为9.3 min，可以和杂质完全分离。

3.2液相色谱串联质谱法
色谱柱：Venusil® HILIC
5 µm，100 Å，2.1×150 mm；

流动相：A：0.5 mmol/L乙酸铵(pH=4.0)
B：乙腈；
进样量：10 µL；柱温：30℃；流速：0.3 mL/min。
表 2 流动相梯度程序

*备注：本文曾尝试过多种 C18 色谱柱，对双氰胺没有保留，需要使用离子对试剂，但是无法用于 LC-MS/MS；也曾尝试过 MERCK ZIC-HILIC 柱，但是得到双氰胺的峰面积偏差较大，分析原因是其具有阳离子交换基团，对双氰胺有不稳定的死吸附。最后确定使用键合丙基酰胺的 Venusil® HILIC 柱，以亲水作用色谱机理对双氰胺进行保留。

质谱条件：
质谱仪：API 4000+；离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测；CAD：8.00； CUR：20.00；GS1：60.00；GS2：50.00；IS：5500.00； TEM：600.00。
表 3 双氰胺质谱信息

4.结果与讨论

4.1高效液相色谱法

实际样品基质加标的线性关系和检出限

准确称取双氰胺标准品 50 mg 于 50 mL 容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，作为标准贮备液；

分别称取 1 g 奶粉试样，添加一定量标准溶液，配制成含双氰胺为 0.5µg/g，1µg/g，2µg/g，5.0µg/mL 和 10µg/ g 的添加样品，按照上述提取、净化方法操作，所得净化液按照上述色谱条件，依次进样检测。以双氰胺含量为横坐标，峰面积为纵坐标，拟合线性方程，结果见表4：

表 4 双氰胺线性方程和定量限 (HPLC 法 )

准确度和精密度

选取市售某品牌婴幼儿奶粉试样，进行添加回收实验，结果见表5

表 5 0.5 µg/g 添加回收实验结果 (HPLC 法 )

4.2 LC-MS/MS法

实际样品基质加标的线性关系和检出限

准确称取双氰胺标准品 50 mg 于 50 mL 容量瓶中，加水溶液并稀释至刻度，作为标准贮备液；

分别称取 1 g 奶粉试样，添加一定量标准溶液，配制成含双氰胺为 5ng/mL，10ng/mL，50ng/mL，100ng/mL和200ng/mL 的添加样品，按照上述提取、净化方法操作，所得净化液按照上述液质条件，依次进样检测。以双氰胺含量为横坐标，峰面积为纵坐标，拟合线性方程，结果见表6：

准确度和精密度

选取市售某婴幼儿奶粉试样，进行添加回收实验，结果见表7。采用空白样品稀释法判断检测方法的基质效应影响。空白净化液稀释和乙腈稀释的标准溶液，双氰胺峰面积和相对丰度比无明显变化，故判断该方法无基质效应的影响。

5. 订货信息