RMC-1大鼠视网膜MULLER细胞的培养操作规程！

RMC-1大鼠视网膜MULLER细胞的培养操作规程！

 

一、背景

 

RMC-1大鼠视网膜MULLER细胞系是一种来源于大鼠视网膜Müller细胞的细胞系，常用于研究视网膜疾病的发生机制、药物筛选和毒性评价等。该细胞系具有以下特点：

 

来源：RMC-1大鼠视网膜MULLER细胞系来源于大鼠视网膜Müller细胞，经过多次传代和筛选，形成了一个相对稳定的细胞系。

 

形态特征：RMC-1大鼠视网膜MULLER细胞系呈多边形或长条形，大小约为15-30微米，胞质丰富，核大而圆，核仁明显。

 

生长特性：RMC-1大鼠视网膜MULLER细胞系生长迅速，传代周期约为24-48小时，可在含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中稳定生长。

 

特异性标志物：RMC-1大鼠视网膜MULLER细胞系表达多种特异性标志物，如Ksp-cadherin、AQP1、AQP2、AQP3、AQP4、NHE3、Na-K-ATPase等，可用于鉴定其视网膜Müller细胞特性。

 

其他特性：RMC-1大鼠视网膜MULLER细胞系还具有一定的增殖能力，可用作研究视网膜疾病发生机制和药物筛选的模型。

 

二、RMC-1大鼠视网膜MULLER细胞系培养操作

 

1)复苏RMC-1大鼠视网膜MULLER细胞系：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

 

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

 

2)RMC-1大鼠视网膜MULLER细胞系传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

 

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

 

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

 

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

 

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

 

3)RMC-1大鼠视网膜MULLER细胞系冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

 

下面T25瓶为例；

 

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

 

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

 

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

 

三、应用

 

RMC-1大鼠视网膜MULLER细胞系可以用于非诺贝特对年龄相关性黄斑变性晚期视网膜纤维化的抑制作用及机制研究：

 

检测非诺贝特对AMD晚期视网膜纤维化的影响,并探讨其作用的分子机制。

 

方法：新生血管性AMD模型采用极低密度脂蛋白受体(Vldlr)敲除小鼠,细胞模型选择RMC-1大鼠视网膜MULLER细胞系。Vldlr-/-小鼠从2月龄开始分别喂食正常饲料或含非诺贝特饲料45天。RMC-1大鼠视网膜MULLER细胞系使用TGF-β2处理后分为溶剂组或非诺贝特酸组。用免疫印迹法和免疫荧光染色检测纤维化标记蛋白的表达来评估视网膜纤维化程度,包括波形蛋白,胶原蛋白,α-SMA和纤连蛋白。Masson染色检测胶原沉积。免疫印迹法检测TGF/Smad信号和Wnt信号激活情况。采用qRT-PCR、Western blot、免疫组化等方法检测胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、结缔组织生长因子(CTGF)的表达。

 

结果：正常饲料组Vldlr-/-小鼠视杯中纤维化标志物Collagen-1、α-SMA和Vimentin表达增加,而这些纤维化标志物在非诺贝特饲料组的小鼠视杯中的表达明显减少。在正常饲料组小鼠视杯中纤维化相关信号通路TGFβ/Smad信号通路和Wnt信号通路中的关键蛋白p-Smad2/3和n-p-β-catenin表达明显升高,而这种升高在非诺贝特饲料组中被抑制。同时,这两条信号通路的下游基因CTGF的表达在正常饲料组中明显升高,而非诺贝特饲料组中相对减少。TGFβ2处理可以使RMC-1大鼠视网膜MULLER细胞系中TGFβ/Smad信号通路和Wnt信号通路激活,这两种信号通路的激活可以被非诺贝特酸抑制。同时,TGFβ2可以使Muller细胞GFAP和CTGF表达增加,使用非诺贝特酸处理后GFAP和CTGF的表达被抑制。结论:非诺贝特抑制视网膜纤维化通过抑制TGFβ/Smad信号和Wnt信号和减少CTGF在新生血管性AMD的释放。非诺贝特可能是一种潜在的治疗AMD纤维化的药物。

 

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