【飞诺美色谱】食品中八种人工着色剂的测定 HPLC 法

人工合成着色剂又称人工合成色素，常以苯、甲苯等为原料，先制备色素中间体，再将一种或两种中间体进行磺化、偶合、缩合和偶氮化等化学反应而制成。《食品中合成着色剂的测定》(GB/T 5009.35-2003)，采用聚酰胺吸附食品中的人工合成着色剂，并用乙醇胺溶液进行洗脱。聚酰胺对合成色素的吸附能力会受到温度的影响，实验时需对样品和淋洗液做加热处理，而且乙醇胺浓缩所需时间过长，此方法不适合大批量样品同时处理，且不易做自动化方法移植。大多数人工合成着色剂均具有苯磺酸钠结构，本实验选用Cleanert®PWAX混合型弱阴离子交换柱，用以吸附食品中的合成着色剂，选用氨化甲醇洗脱，浓缩时间短，适用于大批量样品的同时检测。

1.样品溶液的配置a)乙酸铵溶液(0.02 mol/L)：称取1.54 g乙酸铵，加水溶解并稀释至1000 mL；b)甲醇/甲酸(6+4)溶液：量取甲醇60 mL，甲酸40mL，混匀；c)柠檬酸溶液：称取20 g柠檬酸，加水至100 mL溶解，混匀；d)提取液a：量取无水乙醇70 mL，氨水溶液20 mL、水10 mL，混匀；e)水(pH为6.0)：水加柠檬酸溶液调节pH为6.0；2.样品提取a)饮料类样品：称取10 g样品放入100 mL烧杯中，含二氧化碳的样品加热去除二氧化碳；b)配制酒类：称取10 g样品放入100 mL小烧杯中，加热去除乙醇；c)液体调味料：称取10 g样品放入100 mL小烧杯中，若试样pH值偏高，用柠檬酸水溶液调节pH至6左右；d)固体调味料：称取2 g样品放入100 mL小烧杯中，加入10 mL 1%氨水溶液，涡旋提取1 min，4000 r/min离心5 min，重复提取至提取液无色，合并上清液，用柠檬酸水溶液调节pH至6左右作为待净化液；e)酱料类：称取2 g样品，加入20 mL石油醚，涡旋混合1 min，5000 r/min离心5 min，弃去石油醚上清液，残渣吹干，加入10 mL 1%氨水溶液，涡旋提取1 min，4000r/min离心5 min，重复提取至提取液无色，合并上清液，用柠檬酸水溶液调节pH至6左右作为待净化液；f)果冻、水果罐头：称取已均质样品2 g，装入50 mL离心管中，加入5 mL提取液a涡旋1 min，4000r/min离心5min，重复提取至提取液无色，合并上清液置于80℃水浴中浓缩至2 mL，水洗转移至10 mL比色管中，用水定容(若试样pH偏高，用柠檬酸水溶液调节pH至6左右)；g)肉制品：称取已均质样品2 g，装入50 mL离心管中，加入20 mL石油醚，涡旋混合1 min，4000 r/min离心5 min，弃去石油醚上清液。残渣吹干，加入5 mL提取液a涡旋1 min，4000 r/min离心5 min，重复提取至提取液无色，合并上清液置于80℃ 水浴中浓缩至2 mL，水洗转移至10 mL比色管中，用水定容(若试样pH偏高，用柠檬酸水溶液调节pH至6左右)转移至卓睿全自动固相萃取仪上样管中，待净化。3.固相萃取柱净化SPE小柱：Cleanert®PWAX (150 mg/6 mL)Cleanert®PA (1 g/6 mL)取以上两种固相萃取柱及上述提取液至Qdaura®卓睿全自动固相萃取仪中，完成SPE净化过程：6 mL甲醇，6 mL水(pH值6 ~ 7)；加样10 mL；6 mL水(pH为4)、6 mL甲醇-甲酸(6：4)、6 mL水(pH值6 ~ 7)淋洗；通入空气吹干小柱5 min，6 mL 2%氨化甲醇洗脱并接收，收集液于50℃ 氮气吹干，用1 mL水定容，过0.45 µm水系滤器过滤，待测。

4.实验条件色谱柱：Venusil®XBP C18(L) 5µm 4.6×150 mm；流 速：1.0 mL /min；进样量：20 µL；波 长：254 nm；梯 度：

5.实验结果5.1 Cleanert®PWAX SPE柱添加回收实验通过对不同基质样品的加标实验，对上述检测方法进行验证，结果见下表：

5.2赤藓红净化方法优化赤藓红为苯甲酸钠结构，相对其他苯磺酸钠结构的着色剂，在SPE小柱上保留较弱，国标《GB5009.35-2003》中赤藓红的前处理方法是和其他色素不一样的，采用的是液液萃取的方法。如按照2.2的净化方法操作，在淋洗阶段赤藓红将全部被洗脱下来。通过方法优化，最终淋洗方法确定为6mL水(pH值6 ~ 7)、6 mL甲醇，选用Cleanert®PWAX (150mg/6 mL)，其他条件不变，可满足同时处理9种着色剂的实验要求。注意事项1)若提取液呈碱性，在上样之前要将其pH值调节至6左右，保证小柱对合成着色剂有良好地吸附；2)若样品酒精度过高，建议在上样前对样品进行除醇处理；3) SPE小柱净化过程中，要注意对流速的控制，建议控制在1mL/min左右；4)洗脱液氮吹复溶后，应选用水系滤膜过滤，防止因滤膜吸附造成样品的损失，建议选用Hydrophilic PTFE滤头。5.3结论实验结果表明，Cleanert®PWAX或者Cleanert®PA聚酰胺柱和Venusil®XBP C18(L)液相色谱柱可以用于食品中的合成着色剂的检测，该方法快速、准确。Cleanert®PWAXSPE小柱可同时处理9种着色剂，Cleanert®PA聚酰胺柱可同时处理8种着色剂。