96通道多肽平行纯化加速药物筛选

摘要

减少固相多肽合成（SPPS）过程产生的杂质，对于可靠的结果分析来说非常重要。然而，因为色谱纯化的方式无法进行多肽平行纯化，所以在进行多肽药物筛查（N＞24）的过程中，经常会使用一些低纯度的粗肽，这对最终的结果分析非常不友好。但是，目前我们使用PurePep EasyClean(PEC)技术在96孔板里进行多肽的平行纯化，成功突破了这一瓶颈。

引言

在多肽药物筛查过程中，需要测试数百种不同的多肽，这对多肽药物的验证或进行构效关系的研究至关重要。目前利用基于Fmoc策略的固相多肽合成（SPPS）方法可以快速合成大量多肽样品。但是在合成过程中，由于多肽链的截断或氨基酸的缺失等原因，氨基酸的偶联效率无法达到100%，因此不可避免的会产生一些杂质，通常这些杂质我们会通过反向高效液相色谱（RP-HPLC）的方法去除。然而，反向高效液相色谱（RP-HPLC）受到通量的限制，即每个纯化柱一次只能纯化一个多肽。因此多肽药物筛选主要是基于粗肽来进行，会导致分析结果假阳性或假阴性的风险大大增加，极大阻碍了多肽药物开发的进展。1在此项案例研究中，我们介绍一种可以高效平行纯化多肽的方法，利用Purepep EasyClean(PEC)技术，使用多孔板和真空歧管，实现一次快速平行纯化96个多肽（每个多肽最大10μmol），以此来推动高效可靠的多肽药物开发工作。

方法

合成

在Ramage-Amide-DP-树脂上以10μmol规模在96孔板中（1×45分钟，5倍过量氨基酸）平行合成2×96个肽，然后进行常规封端反应（2M Ac2O，2M pyridine，1×5分钟）。封端步骤可以确保PEC Linker连接子RC+（4倍当量）选择性偶联到目标肽上，偶联时间2个小时（6倍当量DIPEA，6倍当量Oxyma），序列由英国Durham大学化学系Steven Cobb提供。使用TFA/H2O/EDT/PhSMe/TIS（83:5:5:5:2，每10 μmol肽0.5 mL裂解液）进行TFA裂解2h。收集粗肽，沉淀，离心并在96孔板中干燥。图1显示了96个序列中氨基酸的加权分布。

图 1 肽库序列示意图

PEC纯化

为了进行肽库序列的高通量平行纯化，PEC纯化的操作程序适应了96孔板的使用设计。因此，在连接有Linker连接子的修饰肽溶解后，所有后续的步骤借助真空歧管在96孔板上进行，可实现连接子从开始偶联到最终无痕释放的全过程。第一个96孔板上合成的粗肽利用PEC纯化技术纯化，最终收集在深孔板上并直接冻干；第二个96孔板的合成的粗肽不进行PEC纯化，而是裂解、沉淀、溶解在 H₂O/MeCN (7:3) + 0.1% TFA 溶液中进行分析并冻干，以确定粗纯度和产量。

分析

在 Waters 的 Acquity H-Class UPLC-ESI-MS 系统上，利用C-18 柱（1.7 μm，2.1 x 500 mm）进行纯度分析和质谱鉴定；流动相为含有 0.1% TFA 的H₂O（A）和 MeCN（B）混合液；使用已知 210 nm 处消光系数的试剂（0.1 mg/mL Fmoc-L Glutamic acid (OtBu) monohydrate solution）作为内标计算回收率。²

图 2 粗品和 PEC 级 SCP12 和 SCP31 在 210 nm 处的 UPLC-UV/VIS 色谱图

结果和讨论

使用 PEC 技术可使 96 种肽的平均纯度提高 19%（表 1）。

表 1 粗肽和 PEC 级肽的平均结果

利用PEC技术纯化后的肽库没有检测到截短序列，并且只有一种肽的纯度低于 70%（图 3）。与未纯化的粗肽相比，这是一个明显的改进，在未纯化的粗肽肽库中，只有18种肽的纯度高于80%（图3）。PEC级肽的总体回收率为48%。

图 3  96种肽的粗品纯度和 PEC 级纯度分析

图2显示了两种代表性肽的粗肽和PEC级纯化肽的比较色谱图。例如SCP31肽（图2，左）体现了PEC纯化技术的优势：可以有效去除截短序列。这个特点在未优化的合成过程中至关重要。在肽库的制备中，由于96条肽中有76条在其序列中具有一个 Asp-Gly 片段，杂质大部分是由天冬酰亚胺的形成而产生的，如图 2（右）所示。平均而言，由天冬酰亚胺的形成引起的杂质占总杂质的7%。

尽管 PEC 无法完全去除这些杂质，但PEC技术纯化的结果也已经表现了相当的潜力：例如使用 Asp(Dmb/Hmb)Gly 构建块，将使96条肽的平行纯化平均纯度达到87%。

结果一览

1. 使用 96 孔板形式的PEC纯化可以实现大规模并行多肽纯化

2. 一种方法适用于所有的程序，PEC级的肽平均纯度为87%

3. 通过消除多肽相关杂质来提高检测可信度

高通量多肽纯化试剂盒

PTI（Protein Technologies, Inc.）公司的高通量多肽纯化试剂盒采用独特的PEC纯化技术，进行大规模多肽快速平行纯化以保证高度可靠的分析结果。一种纯化方法适用于所有种类多肽纯化，并且一次可平行纯化48或96个多肽，平均纯度高达85%以上；还可降低95%的溶剂消耗量和有机废液的产生，极大降低纯化成本，非常适合PEC级肽库的构建，大大提高筛选和分析结果的可靠性。

多肽合成、切割、纯化——三位一体多肽合成仪

PurePep®Chorus多肽合成仪结合了稳定自动化的多肽合成、多肽切割及多肽纯化；可先平行合成6条不同肽序，并原位切肽，然后在同一台仪器上，平行纯化6条多肽；使用感应加热能快速合成多肽，同时正交捕获-释放PurePep EasyClean (PEC)技术可实现高效多肽纯化；可有效应用于疏水肽(hydrophobic peptides)及聚集肽(aggregating peptides)的合成与纯化。

参考文献

[1] J. R. Currier et al. Clin Vaccine Immunol 2008,15, 267-276

[2] B. J. H. Kuipers; H. J. Gruppen Agr. Food Chem. 2007, 55, 5445-5451