【飞诺美色谱】基于 Cleanert SLE 高通量萃取血浆中维生素 A 与维生素 E

基于 Cleanert SLE 高通量萃取血浆中维生素 A 与维生素 E

— 背景

维生素 A 对人体多种器官的发育以及人体正常生理机能的维护有不可或缺的作用，然而过量摄入维生素 A 会引发毒副作用；维生素 E 作为一种抗氧化剂在体内的主要功能是保护细胞的生物膜结构，最近发现维生素 E 也能调控基因表达，维生素 E 缺乏症虽少见，却与新生儿发育不良和遗传代谢病相关。因此，准确测定人体内维生素 A 与维生素 E 具有重要意义。维生素 A 与维生素 E 由于化学性质活泼，易被氧化，对这类物质的准确定量具有很大的挑战。
本应用案例介绍一种液相色谱-串联质谱的方法，采用 Cleanert SLE 96 孔板净化血浆样品，从血浆样品中萃取富集维生素 A（视黄醇，VA）、α-生育酚（α-VE）和 γ-生育酚（γ-VE），实验方法具有良好的稳定性及可靠性，可为 VA、VE 临床研究提供一种解决方案。
二 目标物信息

三 材料及仪器

Cleanert SLE 96 孔板（200mg/well），Cleanert M96 生物样品前处理仪，Cleanert V96 样品氮吹浓缩仪，96 孔收集板，Bonshell C18（2.1*100 mm, 2.7 μm），以上产品均为天津博纳艾杰尔科技有限公司产品；LC-MS/MS, API 4000+（SCIEX）；VA、α-VE、γ-VE、d6-α-VE、 d4-γ-VE（以上 5 种标准品购自 altascientific）；d6-VA（购自 BUCHEM BV）；甲醇；甲酸；

水；异辛烷；异丙醇；2, 6-二叔丁基对甲酚。

四 样品处理方法

4.1 样品预处理

由于 VA 与VE 稳定性差，为防止被氧化，在实验中需要加入抗氧化剂，所用抗氧化剂为 2,6-二叔丁基对甲酚（BHT）。
取 100 μL 血浆至洁净样品瓶中，加入内标溶液，再加入 50 μL 异丙醇和 50 μL 水溶液， 涡旋振荡混匀。
4.2 SLE 过程

上样：将预混合好的溶液全部上样，静置 5 min；

洗脱：2 mL 异辛烷/异丙醇 (9/1，含 1 g/L BHT)洗脱，每次加入 500 μL，分四次洗脱， 合并洗脱液；最后一步洗脱结束，将 Cleanert SLE 与收集板整体放到Cleanert M96 生物样品前处理仪上，开启压力至 0.02 MPa，约 30 s，完全收集洗脱液。
将洗脱液在室温下用 Cleanert V96 样品氮吹浓缩仪进行温和氮吹干，再使用 500μL 0.1%

甲酸甲醇（含 1 g/L BHT）复溶，进样检测。

五 仪器检测条件

5.1 HPLC 条件

色谱柱：Bonshell C18（2.1*100 mm, 2.7 μm） 流速：200 μL/min
柱温：30 ℃
进样量：5 μL

流动相条件：100%有机相（0.1%甲酸甲醇）等度分离 6min


5.2 质谱条件

扫描模式：电喷雾电离正模式 采集模式：多反应监测（MRM）
表 1 参数信息

六 结果

6.1 线性范围与灵敏度

根据目标物在人体内的含量范围确定标准曲线浓度范围，试验中使用不含目标物的血浆样品配制 7 个不同浓度的校准曲线点，VA 的浓度分别为：0.05、0.15、0.3、0.5、0.8、1、5 μg/mL；α-VE 的浓度分别为：1、2、4、8、10、20、25 μg/mL；γ-VE 的浓度分别为：0.2、
0.5、1、1.5、3、4.5、8 μg/mL；所得样品采用上述样品前处理方法净化样品并进行检测， 获得结果见表 2。
表 2 线性范围及灵敏度

化合物	回归方程	相关系数（r2）	方法定量限 LOQ(μg/mL)
VA	y = 1.3073x + 0.5242	0.9963	0.012
α-VE	y = 1.5237x + 0.1241	0.9914	0.022
γ-VE	y = 2.744x + 0.0425	0.9979	0.034

6.2 方法精密度与准确度

为考察方法精密度与准确度，取低、中、高三个浓度的样本，每个浓度平行处理 6 个

样，获得数据见表 3.

表 3 精密度与准确度

6.3 色谱图

将经Cleanert SLE 净化的样品按上述 LC-MS/MS 测试条件进行测试，获得谱图见图 4-6.

血样中大量存在的磷脂是造成液质联用基质效应的主要原因，为考察 Cleanert SLE 技术去除磷脂的能力，特取磷脂两对特征离子对同时进行考察：496/184，524/184，获得谱图见图 7.

结论

本应用介绍了一种简单、高效的样品前处理方法，通过Cleanert SLE 96 孔板可高通量净化血样并萃取富集脂溶性维生素 A 与维生素 E，本实验方法易操作且稳定，可在临床研究及药物代谢领域替代耗时、低效的液液萃取技术。

八 订货信息表

产品名称	规格/包装	订货号
Cleanert SLE 96 孔板	96 孔板，200mg/well	HC2002-9W
Cleanert M96 生物样品前处理仪	与 96 孔板匹配	SPE-M96
Cleanert V96 样品氮吹浓缩仪	与 96 孔板匹配	NV-96G
96 孔收集板	2mL/well，与 96 孔板匹配	96SP2036-Y
Bonshell C18	2.1*100mm，2.7μm	SC921002-0
甲醇	LC-MS 级, 4*2.5L	LC230
水	LC-MS 级，4*2.5L/箱	LC365