光学显微镜观察方式大盘点：相差

光学显微镜观察方式大盘点：相差

光学显微镜适用于多种检材，如组织切片、活细胞、电路板等。不同检材光学特性差异大，需使用不同观察方式，主要有明场、相差、荧光、偏光、DIC、暗场、霍夫曼相衬七大方式。

一台光学显微镜可能拥有一种或多种观察方式，上期我们介绍了明场，今天来说说相差观察方式。

1935年荷兰物理学家泽尼克（Frits Zernike）发现相衬原理并应用到显微镜上，主要用于观察活细胞等无色透明样品，此种观察方式称为相差观察、相衬观察或泽尼克相衬观察，在生物学研究中应用广泛。

（1）成像原理

人眼只能在光波的波长（颜色）和振幅（亮度）有变化的情况下，才能区分被检物体。对于和周围介质折射率相差不大的透明状物体，光线通过物体时波长和振幅变化不显著，难以分辨。

左图：明场观察的酵母，对比度差

右图：相差观察的酵母，轮廓和细节清晰

培养基与细胞、细胞器与细胞质之间都有明确的分界面，当光线通过这些界面时，一部分光直射通过，另一部分携带界面图像信息的光则成为衍射光。直射和衍射光波长一致，因此颜色一致，衍射光的光程（相位）比直射光多1/4个波长，但人眼无法区分。相差观察利用光的干涉原理，将这个光程相位差，转换成振幅（亮度）变化，从而提升了分界面的衬度，让人眼可以区分。

相差原理光路图

两束波的叠加，上图为相隔π/2相位的叠加波，叠加后的波形振幅得到加强，表现为变亮；下图为相隔π相位的叠加波，叠加后的波形振幅被减弱，表现为变暗

（2）关键部件

相差观察需要相差聚光镜和相差物镜两个特殊部件，其效果还会受光源光强影响，因为从明场切换到相衬时会显著降低成像亮度。

①相差聚光镜是在光源与聚光镜之间加入相差环（环形光阑annular diaphragm）实现的，作用是使透过聚光镜的光线形成环形光。相差环的环状孔（中空环）直径和孔宽与物镜内的相位环板匹配，形成的像恰好落在物镜后焦面与相位板上的共轭面重合，因此不同倍数物镜要与不同倍数的环匹配。

相差环可通过推拉环板、转盘聚光镜等形式切换进出光路，倒置显微镜通常使用聚光镜相差环板推拉实现切换。

相差环板，内嵌两个相差环和一个明场通道

产品小知识：相差环附近有对中螺丝，用于对中相差环，非必要勿拧

②相位板（annular phaseplate）：相差物镜镜片中有氟化镁等材料制作的的相位板，是相差效果的核心。按相差物镜种类可分为正相差和负相差，正相差常见，物镜标记Ph，背景变暗，样品边界外围形成白色光环。

负相差比较少见，物镜标记Nh，背景非常暗，样品边界内围形成白色光环。

带有相位板的相差物镜，一般会标注Ph字样

使用小技巧：相衬物镜光通过率会降低，一般只适合明场和相差使用。对于iPS细胞和ES细胞等需要使用塑料培养皿的样品，建议选购明美半复消色差的相衬物镜，才能同时满足相差和荧光观察。

③对中望远镜 (centering telescope)：也叫合轴调节望远镜，是用于调中相衬环的配件，未调中的相差环会导致相差效果大打折扣。

对中望远镜

对中望远镜调节相差环对中

（3）成像特点

相衬观察成像特征是变暗的背景和样品边缘出现较厚的白色光环，主要用来看活细胞、水生物、薄组织切片之类透明样品，可以呈现样品细节，在厚度5-10μm时效果较好，厚样品、非透明样品看起来可能跟明场差不多。

（4）主要应用

①活细胞培养观察

左图：贴壁细胞；右图：悬浮细胞

②水生生物（昆虫、藻类等）观察

用相差显微镜观察车轮虫，左明场右相差

（5）明美产品

①倒置显微镜

产品：MI40/MI52-N/MI52-CF/MIX60

配置白光LED光源，成像清晰锐利

标配明场和相差观察方式，使用便捷

可适配不同规格培养器皿

适用于细胞观察、水生生物等科研或行业场景

②活细胞成像仪

产品：MCS11/MCS21/MCS22

体积小巧，可放置在培养箱内长时间监测成像

配置相差环与相差物镜，细胞观测更专业

可额外配置荧光观察方式

③相差显微镜ML31-PH

无限远光学系统，高品质的相差观察效果

10X/22mm大视野目镜，观察舒适视野宽广

良好的扩展性能，可更换配件实现明场、暗场等观察

本期的文章就到这里，希望对大家有帮助，下一期我们介绍荧光观察。

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来源：https://www.mshot.com/article/2013.html