Tissue Cytometry技术为胆管癌相关IL-6信号通路的多组学可视化研究提供策略

胆管癌 （CCA） 是第二常见的肝原发性恶性肿瘤，其金标准治疗是手术。不幸的是，由于晚期诊断和频繁的主要血管浸润，CCA 很少适合根治性切除。大血管浸润历来被认为是切除术的禁忌证，但在对胆管癌的非手术治疗方案研究中，少有涉及针对胆管癌血管侵袭靶点的机制性研究。其难点在于胆管癌具有高度的生物学异质性，肿瘤微环境复杂，缺乏有效可靠的评估手段。

胆管癌是一种典型的炎症诱导性恶性肿瘤，升高的白细胞介素-6（IL-6）水平与CCA的发病和进展有关。本研究旨在探讨IL-6通路在CCA中的潜在预后价值。

陆军军医大学西南医院李大江教授团队在Frontiers in Immunology发表题为“Expression and clinical significance of interleukin-6 pathway in cholangiocarcinoma”的文章。本研究的发现表明IL-6信号通路可能对CCA具有潜在的预后价值。需要进一步研究以了解CCA中IL-6通路的潜在分子机制。

本文使用多重免疫荧光技术检测了CCA的TMA样本中IL-6、IL-6R、糖蛋白（gp130）、C-反应蛋白（CRP）、Janus激酶2（JAK2）和转录激活因子3（STAT3）的表达。此外，文章还评估了临床相关性和预后价值。最后，进行了单细胞转录组分析，以评估CCA中IL-6通路基因的表达水平。

研究结果显示，与正常组织相比，肿瘤组织中IL-6的表达较低，而STAT3的表达较高。尤其在肿瘤微环境中的研究中，IL-6通路基因的表达普遍下调。重要的是，gp130在肿瘤组织中与JAK2强相关，而在正常组织中与JAK2的相关性较弱。虽然没有基因表达与总生存率和无病生存率直接相关，但我们的研究发现，IL-6、IL-6R、CRP、gp130和JAK2与血管侵袭呈负相关，这是CCA患者预后不良的风险因素。

实验部分

本文作者利用Tissue Cytometry技术，针对胆管癌TMA组织芯片进行多重免疫荧光标记，在获得TMA芯片中单细胞染色信号的强度和分布的基础上，通过大量的Spearman回归算法分析，确定了IL-6通路IL-6、IL-6R、gp130、CRP、JAK2和STAT3基因表达之间的相关性。

值得一提的是，Tissue Cytometry为IL-6信号通路的研究提供了一个强大的工具，并使得这一复杂的生物过程得以可视化。通过Tissue Cytometry技术，研究人员能够在单细胞水平上观察并定量IL-6及其受体与细胞内信号分子的相互作用，结合mIHC多重免疫荧光染色与Tissue Cytometry技术中流式散点图圈门的分析思路以及正反向回溯的追踪验证模式，极大提升了数据的可靠性与可信度，这对于深入理解IL-6在疾病中的作用至关重要。

文章最后借助单细胞测序技术，从转录水平层面进行了交叉验证，让数据更加准确真实，也拓展了空间多组学研究思路在胆管癌中的应用。

使用TissueGnostics公司TissueFAXS Plus全景组织扫描定量分析系统获取图像。获取到图像利用StrataQuest软件进行定量分析，

首先， 作者 使用了光谱库来获得单通道荧光信号，然后使用DAPI通道来识别有效的细胞核。以细胞核为核心，我们根据每种 marker 的染色的情况设置了阈值，将 marker 表达阳性的细胞群分开，并计算了阳性细胞的数量。 本文 还计算了双阳性细胞的数量和强度。最后，使用平均强度乘以阳性细胞的百分比来表示 marker 的表达水平 。

Figure 1 多重免疫荧光检测胆管癌组织中IL-6、IL-6R、gp130、JAK2、STAT3和CRP的表达。

(A)IL-6(黄色)、gp130(绿色)和JAK2(红色)的多重免疫荧光图像。

(B)IL-6R(绿色)、STAT3(黄色)和CRP(红色)的多重免疫荧光图像。

(C)IL-6(黄色)、gp130(绿色)和JAK2(红色)平均强度的分布。

(D)IL-6R(绿色)、STAT3(黄色)和CRP(红色)平均强度的分布。

Figure 2 应用StrataQuest软件对MIF样本中肿瘤组织(蓝色)和正常组织(红色)中IL6(A)、IL6R(B)、gp130(C)、JAK2(D)、STAT3(E)和CRP(F)的表达差异进行评估。

Figure 3应用StrataQuest软件对IL-6、IL-6R、gp130、JAK2、STAT3、CRP在双阳性和三阳性细胞中的表达差异进行评估。

(A)IL-6R+CRP+细胞中IL-6R和CRP的表达。

(2)IL-6R+STAT3+细胞中IL-6R和STAT3的表达。

(C)IL-6R+CRP+STAT3+细胞中IL-6R、CRP、STAT3的表达。

(D)IL-6+gp130+细胞中IL-6和gp130的表达。

(E)IL-6+JAK2+细胞中IL-6和JAK2的表达。

(F)IL-6+gp130+JAK2+细胞中IL-6、gp130和JAK2的表达。

Figure 4 应用StrataQuest软件对IL-6、IL-6R、gp130、CRP、JAK2、STAT3的相关性分析。

Figure 5应用StrataQuest软件对IL-6和IL-6R在有血管侵犯和无血管侵犯患者中的表达差异。

(A)IL-6+gp130+细胞中IL-6的表达。

(B)IL-6+JAK2+细胞中IL-6的表达。

(C)IL-6+gp130+JAK2+细胞中IL-6的表达。

(D)IL-6R+CRP+细胞中IL-6R的表达。

(E)IL-6R+STAT3+细胞IL-6R的表达。

(F)IL-6R+CRP+STAT3+细胞IL-6R的表达。