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样本制备

SDS- PAGE电泳

注意事项：

1. 配胶试剂里面的 AP 需要根据实验室实际温度来适量的增加或者减少，比如夏天温度较高, 自然凝胶速度较快，AP 的量需要适当的减少；冬天温度低，凝胶慢，需要适量的增加。

2. 灌胶时掌握好速度，避免气泡产生（注意浓度越小的胶含水越多，凝固后胶体积缩小越多）。加水液封时速度要很慢，否则胶会被冲变形。

3. 所有的蛋白样品定量一致，体积一致，不够的用裂解液补足，样品两侧的泳道用等体积 的1×Loading Buffer 上样，Marker也用1×Loading Buffer调制与样品等体积，这样可以避免出现误差。

4. 电泳时间和电压说法各异。一般电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。为减少蛋白质条带的扩散，上样后应尽快进行电泳，电泳结束后也应直接或者转印。

蛋白转膜

注意事项：

1. 选择合适的膜和缓冲液是确保蛋白转印成功的关键。必须通盘考虑蛋白质的大小和电荷、转印方法和膜的结合特性。

2. 切滤纸和膜时一定要戴干净手套，因为手上的蛋白会污染膜。PVDF 膜使用前用无水甲醇中浸泡 1min~2min。

3. 用枪头或移液管在叠层的滤纸上滚动，除去气泡。注意每叠一层就要用玻璃棒或圆筒试管赶去气泡，因为一个气泡的厚度对于蛋白来说都是十万八千里的。

4. 用干净纱布将叠层上面和周围的多余缓冲液吸干。这一步很重要，宁可太干也不能太湿，太干容易烧胡，太湿的话多余的缓冲液会导致电流短路，大大降低转移效率。

封闭

注意事项：

做磷酸化蛋白的western时使用BSA（牛血清蛋白）作为封闭液。奶粉含有酪蛋白（一种磷酸化蛋白），如果用奶粉，有可能出现背景深的现象。并且脱脂奶粉含磷酸酶，磷酸酶与膜上的磷酸化蛋白接触可使之去磷酸化，用磷酸化特异性抗体分析磷酸化蛋白时会受到影响。

抗体孵育

注意事项：

1. 为减少非特异结合,可选用封闭液作为一抗和二抗的抗体稀释液。

2. 一抗孵育条件推荐 4°C过夜, 二抗孵育条件为室温,1h。

3. 洗涤液推荐选用 TBST 缓冲液。洗涤时应保持适中的摇床速度,避免过快导致膜上的蛋白 或抗体脱落,同时确保洗涤液能够充分接触到膜上的每一个角落。在洗涤过程中,适时更换新的洗涤液以确保洗涤效果。

4. 洗涤过程中需要保持膜的湿润,避免膜干燥导致抗体结合力下降或蛋白变性。

发光显影

注意事项：

1. 采用暗室胶片曝光方法，操作需要尽量熟练，除了要把握曝光时间，还要避免位移（压片、取片过程中胶片和杂交膜不能有移动）；保留好胶片，作为原始凭证；

2. 使用化学发光成像仪采集图像，注意采集白光下的图像，并与发光的图像进行融合，作为原始凭证保存。