钙离子(Ca2+)是机体各项生理活动不可缺少的离子,是细胞内重要且广泛存在的第二信使。监测活细胞内钙水平,对探究生物活动相关的信号机制及规律至关重要。传统的合成钙指示剂,使用方便、可靠性高、动态范围广、光谱化学特性多样。经过优化的基因编码钙指示剂(GECIs),在许多应用中可与其效果相媲美,尤其是GECIs表达稳定,可有效降低试剂成本,简化分析过程,比合成钙指示剂更有优势。
来自Janssen研发有限责任公司的Nyantsz Wu等人,构建了一个稳定表达GCaMP6s的克隆细胞系,并通过流式细胞仪(flow cytometry)和荧光成像(FLIPR)等技术,对荧光基因编码钙指示剂GCaMP6s与合成钙指示剂fluo-4进行了性能比较,相关研究以“High-throughput-compatible assays using a genetically-encoded calcium indicator”为题,发表在《Scientific Reports》上。
实验中,采用美国Orflo公司的Moxi GO II流式细胞仪进行流式细胞实验,通过488nm激发激光和525/45nm发射滤光片,配合PMT检测荧光强度,采用Coulter法测定细胞大小,直径小于9微米的细胞被认为是碎片,排除在计数数据之外。
首先,流式细胞实验对GCaMP6s与fluo-4的荧光光谱进行分析,比较fluo-4标记293-F细胞与用pGP-CMV-GCaMP6s转染 24小时的细胞的荧光强度(图1. a-c)
图1. 流式细胞实验对数变换荧光强度直方图. (a)未标记细胞,(b)瞬时表达pGP-CMV-GCaMP6s,(c)标记fu -4的细胞
(用缓冲液(红色)或10μM钙离子通道载体(蓝色)处理细胞)
然后,基于共聚焦显微镜和流式细胞仪,对GCaMP6s与fluo-4分别处理的细胞内钙离子变化进行可视化分析(图2)。
图2. 用GCaMP6s(a-c)和fluo -4(d-f)分别标记的稳定表达GluA 1o -γ4 293-F细胞共聚焦图像和流式细胞术检测结果(c,f)悬浮细胞流式细胞术荧光强度直方图:CP-465022(红色),谷氨酸+ LY-395153(橙色),钙离子通道载体(蓝色)
最后,对流式细胞实验结果进行总结(表)。在每次实验中,测量所有直径大于9μm细胞的计数平均值(运行1,800-11,000个细胞)。数据以每次结果的平均值±标准差表示,实验次数用括号表示。细胞处理为CP-465022 (FCP);谷氨酸+LY-395153 (FPAM);钙离子通道载体 (Fiono)。ΔF为(FPAM -FCP)或(Fiono -FCP)。
通过流式细胞实验可以直接比较两种荧光指示剂的荧光强度。FLIPR(高通量实时荧光检测)实验测量大约10,000至20,000个细胞的总荧光强度,可以通过流式细胞仪测量大约10,000个细胞的算术平均值来模拟。研究人员发现,GCaMP6s标记的细胞在总荧光输出上比fluo-4标记的细胞低,但足以在FLIPR实验中提供稳健的反应。
作为一种新型的荧光基因编码的钙指示剂,GCaMP6s具有高亲和力、高表达量,不需要额外的染料加载,降低试剂成本,在细胞内Ca2+浓度变化的监测上显示出与fluo-4相当的动态范围和响应特性。此外,GCaMP6s还可以通过标准的分子生物学技术进行改造,以适应特定的实验需求。文章认为GCaMP6s是一个有前景的新型工具,作为合成钙指示剂的替代品,可以用于各种细胞生物学和药理学研究,尤其是在需要高通量筛选的现代药物发现领域。
在这项研究中,Moxi GO II作为一个实验工具,即开即用,操作简便,对于实现快速、准确的细胞内钙离子水平检测至关重要,对评估GCaMP6s这一遗传编码钙指示剂的性能和应用潜力具有重要意义。
美国Orflo Technologies公司将行业公认的细胞计数金标准——库尔特原理(Coulter Principle),与荧光流式检测技术相结合,推出的新一代快速流式细胞仪——Moxi GO II,提供超准确的细胞计数、细胞活率检测,以及超高分辨率的细胞粒径测量。库尔特原理对颗粒个体进行逐个三维测量,不但能准确测量颗粒的粒径分布,更能进行粒子绝对数目和浓度的测量。由于检测时不受激光衍射、散射因样本颜色或浓度变化的影响,库尔特原理所测粒径大小更接近真实。
Moxi GO II快速流式细胞仪,采用库尔特原理进行细胞计数和粒径测量,同时采用488nm激光光源,结合两个PMT通道,525/45nm通道和561nm/LP(或者646nm/LP,可根据需要更换),进行细胞活率、细胞凋亡、转染效率、活性氧簇、线粒体膜电位等常规流式检测。仪器设计小巧轻便,无需预热,开机即用,预设程序,触屏操控,运行后10秒即可给出测试结果,使用后也无需清洁维护。无论是经验丰富的流式专家,还是初试身手的实验小白,Moxi Go II都可以助您轻松完成实验。
美国Orflo Technologies公司是一家非常专业的细胞分析仪器研发和制造企业,拥有多项专利技术,产品以库尔特原理的高精细胞计数仪和超快流式细胞仪为主。
环亚生物,生命科学产品全国性代理商,不断把国外顶级的创新产品引入中国。环亚生物具备完善的公司运营、产品管理、营销、售前技术支持和售后维修体系。作为Orflo Technologies中国地区独家代理,环亚生物科技有限公司全权负责Orflo Technologies产品在中国地区的推广、销售,为广大用户提供专业的技术咨询和产品服务。
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https://doi.org/10.1038/s41598-019-49070-8
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