EASYSPIN 细菌RNA快速提取试剂盒的特点与储存及注意事项!
一、概述
EASYSPIN 细菌RNA快速提取试剂盒采用独特的裂解液迅速裂解细胞和灭活细胞RNA酶,然后用乙醇调节结合条件后,RNA在高盐状态下选择性吸附于离心柱内玻璃纤维素膜,再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤,去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物、蛋白等杂质去除,最后低盐的RNase free H20将纯净RNA从玻璃纤维素膜上洗脱。适用于快速提取细菌总RNA。
二、产品特点
离心吸附柱内玻璃纤维素膜全部采用进口特制吸附膜, 柱与柱之间吸附量差异极小,可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
不使用有毒的苯酚,氯仿等试剂,也不需要乙醇沉淀等步骤。
快速简捷,单个样品操作一般可在30分钟内完成。
多次过柱漂洗可确保高纯度,OD260/OD280典型的比值达1.9-2.0, 基本无DNA残留, 可用于RT-PCR,Northern-blot和各种实验。
三、产品储存
所有的溶液应该是澄清的, 如果环境温度低时溶液可能出现沉淀, 此时不应该直接使用,可在37℃水浴加热几分钟, 即可恢复澄清。
不合适的储存于低温(4℃或者-20℃)会造成溶液沉淀, 影响使用效果, 因此运输和储存均在室温下(15℃-25℃)进行。
避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、 pH值变化, 各溶液使用后应及时旋紧盖子。
四、试剂盒组成、储存、稳定性
本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。
五、储存事项
1、所有的溶液应该是澄清的,如果环境温度低时溶液可能形成沉淀,此时不应该直接使用,可在37℃水浴加热几分钟,即可恢复澄清。
2、不合适的储存于低温(4℃或者-20℃)会造成溶液沉淀,影响使用效果,因此运输和储存均在室温下(15℃-25℃)进行。
3、避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化,各溶液使用后应及时盖紧盖子。
六、注意事项
1、次使用前请先在漂洗液RW瓶加入指定量乙醇,加入后请及时打钩标记已加入乙醇,以免多次加入!
2、所有的离心步骤均在室温完成,使用转速可以达到13,000 rpm的传统台式离心机,如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。
3、需要自备乙醇。
4、裂解液RLT 和去蛋白液RW1中含有刺激性化合物,操作时要戴乳胶手套,避免沾染皮肤,眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时,要用大量清水或者生理盐水冲洗。
5、预防RNase 污染,应注意以下几方面:
1)经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌,可能导致RNase 污染。
2)使用无RNase 的塑料制品和枪头避免交叉污染。
3)RNA 在裂解液RLT 中时不会被RNase 降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase 的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4 小时,塑料器皿可在0.5 M NaOH 中浸泡10 分钟,然后用水彻底清洗,再灭菌,即可去除RNase。
4)配制溶液应使用无RNase 的水。(将水加入到干净的玻璃瓶中,加入DEPC至终浓度0.1%( v/v),37℃放置过夜,高压灭菌。)
6、关于DNA 的微量残留:
一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微量残留,本公司的EASYspin系列RNA提取产品,由于采取了本公司独特的缓冲体系和选择了特殊吸附能力的吸附膜,在大多数RT-PCR 扩增过程中极其微量的DNA残留(一般电泳EB染色紫外灯下观察不可见)影响不是很大, 如果要进行严格的mRNA表达量分析如荧光定量PCR,我们建议在进行模板和引物的选择时:
选用跨内含子的引物,以穿过mRNA中的连接区,这样DNA就不能作为模板参与扩增反应。 选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。 将RNA提取物用RNase-free的DNase I 处理。本试剂盒还可以用于DNase I处理后的RNA清洁(cleanup),请联系我们索取具体操作说明书。 在步骤去蛋白液RW1漂洗前,直接在吸附柱RA上进行DNase I处理。请联系我们索取具体操作说明书。
7、RNA 纯度及浓度检测:
完整性:RNA 可用普通琼脂糖凝胶电泳 (电泳条件:胶浓度1.2%;0.5×TBE电泳缓冲液;150v,15 分钟)检测完整性。由于细胞中70%-80%的RNA 为rRNA,电泳后UV 下应能看到非常明显的rRNA 条带。动物rRNA 大小分别约为5 kb 和2kb,分别相当于28S 和18S rRNA。动物RNA 样品中rRNA 亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0 倍,否则表示RNA 样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。
纯度:OD260/OD280 比值是衡量蛋白质污染程度的参考指标。高质量的RNA,OD260/OD280 读数(10mMTris, pH7.5)在2.1-2.2 之间(100%纯的RNA比值一般是2.2左右,很多公司无法达到这个标准,所以1.9-2.0就凑合用了,但是我们的产品标准一般可以达到2.1-2.2)。OD260/OD280 读数受测定所用溶液的pH 值影响。同一个RNA 样品,假定在10mM Tris,pH7.5 溶液中测出的OD260/OD280 读数1.8-2.1 之间,在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9 之间,但这并不表示RNA 不纯。
浓度:取一定量的 RNA 提取物,用RNase-free 水稀释n 倍,用RNase-free水将分光光度计调零,取稀释液进行OD260, OD280 测定,按照以下公式进行RNA浓度的计算:终浓度(ng/μl)= (OD260)×(稀释倍数n)×40。
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