在药物研发中，二维的细胞单层已被广泛用来评估药物功效，包括分析有效药物浓度和作用机制。然而，将2D培养的细胞用于高通量的药物筛选评估存在一定的问题，因为生物组织中的细胞会表现出不同的药物反应或耐药性，因此很难进行正确的评估。目前，我们已知球状体等细胞聚集体形成三维 (3D) 结构后会表现出与生物体内相似的反应（Ref. 1）。出于这个原因，近年来细胞球状体在药理和毒素评估中的应用有所增加。此外，由于球状体的外层和内层的形状结构不同，其特性和物理化学环境也不同（Ref. 2），因此三维结构中空间相关的信息对于药效分析也很重要。为了获取清晰的 3D 图像、使用显微镜对大量样本进行高通量成像以及 3D 图像的分析至关重要。 AX R 共聚焦显微镜可以获得具有层切面效果的清晰 3D 图像。利用NIS-Elements成像软件的自定义图像采集JOBs功能可以实现无缝成像，联合使用自定义图像分析GA3 (General Analysis 3）功能可以提供复杂的3D定量分析。本应用说明介绍了通过星形孢菌素的药物处理（已知对球状体具有抗癌作用）从采集到分析 3D 图像的案例。 关键词：AX R，NIS-Elements JOBs/GA3，3D 分析，球状体，毒性评价
将50个来自人类结肠腺癌的HT29细胞种在圆底96孔板中并培养3天形成球状体。将形成的球状体转移到平底96孔板中，并使用不同浓度staurosporin处理24小时。之后，对细胞核和凋亡细胞进行染色，并使用显微镜获取图像。 搭载AX R共聚焦显微镜系统的Eclipse Ti2-E倒置显微镜用于成像，NIS-Elements AR v5.42.00软件进行显微镜控制和图像分析。为了简化成像，可以用NIS-Elements的JOBs功能，用低倍率（4倍）物镜确定每个孔中球状体的XY坐标。在该坐标上，将物镜切换到成像放大倍数（40倍），并自动确定Z范围（检测球状体内细胞核的荧光信号的地方）。在这些XY坐标和这个Z-范围内获取球状体的三维图像。NIS-Elements的GA3分析功能可对球状体内的所有细胞核进行检测和并测量荧光强度。 实验结果
每个孔都可以获得清晰的三维球体细胞核图像，并且可以通过GA3功能分离和检测单个细胞核(图2)。 图2：AX R获取的球状体的细胞核影像，使用的是CFI Plan Apochromat Lambda 40XC 物镜。（A）3D荧光图 （B）用NIS-Elements的GA3分析模块检测细胞核。
如图3所示，随着staurosporin浓度的增加，细胞球状体直径逐渐减小，且凋亡细胞增加（细胞核为红色，诱导凋亡细胞呈现绿色)。 
图3：用共聚焦拍摄的细胞球状体在不同staurosporine浓度下的状态（红色代表细胞核，绿色为诱导凋亡细胞）。比例尺：50 µm. 此外，利用GA3分析模块进行详细的三维定量分析后，结果显示，在0.25 uM及以上的浓度下，凋亡的细胞数量增加，且细胞密度降低(图4 (A-C))。分析还显示，浓度为1 μ M及以上时，凋亡细胞比例下降，细胞数量减少(图4 (D))。 
图4：不同药物浓度下细胞球状体的3D定量分析结果 。（A）细胞球状体中凋亡细胞的荧光强度。（B）凋亡细胞比例 （C）基于荧光标记的细胞核提取出的细胞体积大小。（D）细胞数量的变化。 通过AX R共聚焦显微镜获取的图像，GA3可以清晰地检测到每个球体的细胞核。这使得可以根据需要进行各种定量分析，例如体积和短/长直径，以及荧光强度和细胞计数外。AX R和JOBs的组合使得整个孔板的成像从开始到完成实现了全自动化采集。此外，即使孔内存在多个球体，这种自动化也可以避免可能遗漏某些球体的情况。因此，尽管整个区域的图像传统上已经可以利用手动检测来实现，但该方法可显著提升通量。
这次的实验结果显示，staurosporine引起的凋亡效应和细胞密度的下降可以进行定量。图4（A-B）显示了浓度依赖性的变化，表明细胞对药物浓度有准确的响应。
从解决使用2D培养细胞带来的问题和减少动物实验次数的角度来看，球体和类器官等3D样品有望扩大在癌症治疗药物等药物发现研究中的应用(Ref.3)。利用AX R共聚焦显微镜和JOBs高效获取高分辨率3D图像，构建灵活的成像序列，并利用GA3进行各种图像分析。将对药物研发做出相当大的贡献。详情请点击文末阅读原文。
产品信息
NSPARC超分辨探测器，含有25个检测的单元，获得的图像具有优于常规共聚焦分辨率和高的信噪比。
自定义图像采集和分析模块JOBs/GA3
JOBs是NIS-Elements AR 的一个插件模块，可选软件，可通过整合显微镜控制、图像采集、处理和分析、数值计算、条件分支和外部设备控制等功能来定制成像流程，它为用户提供了完全灵活的实验设计功能，高效完成的图像采集和分析。 GA3（General Analysis3）是NIS-Elements AR 的一个插件模块, 高效整合图像前处理、图像分割、目标物测量和数据导出等图像分析流程。可以根据图像分析需求定制复杂工作流程（例如 3D 体积成像和 4D 跟踪）, 实现图像分析的自动化。
1. B. Calpe and W. J. Kovacs, "High-throughput screening in multicellular spheroids for target discovery in the tumor microenvironment". Expert Opinion on Drug Discovery. Vol. 15(8). (2020). 2. Y. Feng and R. M. Eglen, "Three-dimensional cell cultures in drug discovery and development". SLAS Discovery. Vol. 22 (5). (2017). 3. V. Brancato et al. "Could 3D models of cancer enhance drug screeding?" Biomaterials. Vol. 232. (2020).
