江南大学徐岩范文来教授团队在Food Chemistry发表研究成果：基于“曲组学”阐明高温大曲制曲

江南大学徐岩范文来教授团队在Food Chemistry发表研究成果：基于“曲组学”阐明高温大曲制曲（全二维气相色谱飞行时间质谱联用仪（GCxGC-TOFMS)

2023年11月，江南大学徐岩、范文来教授团队和茅台学院杨亮副教授在国际食品期刊Food Chemistry(Q1, Top, IF:8.8)发表最新研究成果：“Qu-omics elucidates the formation and spatio-temporal differentiation mechanism underlying the microecology of high temperature Daqu”。徐岩教授和范文来教授为该论文的通讯作者，杨亮副教授为第一作者。

研究背景：

高温大曲（HTD）作为白酒的糖化剂、发酵剂及发香剂，在白酒酿造过程中起着举足轻重的作用，对于白酒风味的形成有着深远的影响。微生物群落的时空分布和构建机制一直是传统食品发酵研究中的难题。即使在同一曲仓内发酵，高温大曲也会形成多种微生态。高温大曲发酵有显著的生境异质性。在大曲生产过程中，同一种大曲是如何分化成异质微生态的，这一点仍有待阐明。

研究意义：

此项研究利用曲组学技术，分析了高温大曲（HTD）生产过程中生态及理化指标的变化，并且系统研究了发酵室不同发酵层内的微生态特征和高温大曲的生长发育过程，解释其生产过程中微生态分化机制，为实现均匀、高质量HTD发酵奠定理论基础。

研究亮点：

Ø 提出了曲组学的概念，并用此方法对高温大曲微生态的形成机制进行了研究。

Ø 探明了制曲过程中各层大曲内部微生物结构的差异。

Ø 明确了制曲过程中微生物群落的蛋白质表达发生的变化、生态分化的优势微生物及其功能表达、代谢表征及驱动因素。

Ø 阐明了调节各曲层群落的关键环境因素。

GCxGC-TOFMS型号及参数：

研究结论：

1. 制曲过程中各层大曲内部微生物结构的差异

在高温大曲发酵过程中，同一曲室内不同发酵点的发酵环境存在显著差异，且不同曲室之间的环境差异超过了同一曲室不同发酵点之间的差异。研究发现，在制曲过程中，通过ACE指数测量，微生物群落多样性呈先下降后趋于平稳的趋势。相反，用香农指数测量，群落多样性先下降，随后呈现上升趋势。不同曲层的丰富度和多样性差别迥异，主要集中在制曲初期。

Bacillus, Kroppenstedtia, Saccharopolyspora, Scopulibacillus, Virgibacillus, Weissella, Thermoactinomyces, Lactobacillus, Oceanobacillus, 和Streptomyces为HTD的主要细菌类群。Thermoascus, Thermomyces, Saccharomycopsis, Pichia, Aspergillus, 和 Rasamsonia 为HTD的主要真菌类群。此外，中层大曲中微生物种群表现出更加强烈的互作关系，对于微生物共生更加有利。Corynebacterium, Sphingobacterium和 Lysinibacillus 被确定为关键微生物类群，对大曲生态系统的动态演替过程起到关键作用。

图1. 高温大曲在曲室发酵过程中微生物群落的演替及互作

2. 制曲过程中微生物群落的蛋白表达发生变化

在制曲过程中，共检测到269个属所表达的1541种蛋白质。大曲的功能细菌主要包括Bacillus, Oceanobacillus, Geobacillus, Virgibacillus,和其他相关菌属。主要功能真菌包括d Aspergillus, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Neurospora以及其他相关菌属。此外，微生物之间酶表达的差异对不同发酵层内的物质代谢产生重大影响。在发酵早期，18个微生物菌属（Bacillus, Virgibacillus等）在上层发酵层中的蛋白表达量显著高于中层和下层。在发酵中后期，真菌的蛋白表达量最高，而细菌在下层蛋白表达更多。

微生物之间酶表达的差异对不同层状结构内的物质代谢产生了重大影响。研究发现，不同层内的代谢途径主要以原料代谢为主，包括碳水化合物代谢、氨基酸代谢和其他相关过程。在制曲的早期阶段，上层发酵层中酶和总蛋白的表达量高于其他空间位点。然而在发酵中后期，中层发酵层酶和蛋白质表达量最高，氧化还原酶系统始终表现出最高的蛋白表达含量。

图2. 仓内发酵过程中不同曲层大曲内的微生物源蛋白质组

3.大曲形成过程中微生物种群的生态位分化

利用大曲微生物源元蛋白组的KEGG同源组（KO）计算杰卡德距离（Jaccard distance），研究发现，不同层的群落受周围环境的影响，导致生态位逐渐分化，中层的群落多样性最高，下层最低。通过网络拓扑分析，发现中层微生物种间关系更为密切，通过酶表型评估，中层群落的功能表达更高，生态位多样性更高，对底物的利用率更高。

图3 不同曲层的大曲微生物群落基本生态位和相应的功能微生物

4.大曲形成过程中群落代谢表征发生分化

在制曲过程中，采用HS-SPME-GCxGC-TOF/MS（美国LECO公司Pegasus 4D）技术共检测到1588种化合物，其中共407种在制曲过程中通过微生物介导或化学反应形成和转化而来。研究发现，不同空间点位大曲，底物的降解率与代谢物的多样性无关，但使用PLS-DA模型，15种特定的生物标记物仍能有效区分不同发酵层的大曲。通过应用STEM发现，在不同时间和空间维度，参与关键差异代谢途径的功能酶的表达水平存在显著差异，这是导致大曲内代谢表型差异的生物学原因。

图4 大曲内的化合物及代谢路径富集

5. 制曲过程中的驱动因素

采用 β-NTI和基于RCbray的Bray-Curtis来评估不同组装过程对制曲过程中群落形成的相对影响。总体而言，随机组装对细菌群落形成的贡献率显著高于确定性组装。在大曲的群落组装过程中，细菌主要表现为随机组装，而真菌则表现为确定性组装。

图5 大曲内的微生物组装过程

6. 微生态分化的驱动因素分析

在高温高湿的恶劣条件下，制曲过程中微生物会发展出独特的适应策略来应对特定的压力，这些适应策略可导致群落组装过程中的分化。研究发现，在群落组装过程中，酸碱度、温度、湿度和酸度与不同生境中微生物群落的相互作用促进了高温大曲的微生态分化。

图6 环境因子与大曲内微生物结构RDA分析

作者介绍：

徐 岩，教授、博士生导师、江南大学原副校长，美国化学学会(ACS)农业与食品化学部Fellow、教育部长江学者与创新团队的发展计划团队带头人、首批教育部新世纪优秀人才、全国优秀教师、享受国务院政府特殊津贴。徐岩教授目前担任江南大学酿酒科学与酶技术中心主任、中国酒业协会副理事长，中国酿酒工业协会白酒技术委员会副主任，中国蒸馏酒产业技术创新战略委员会理事长。担任Systems Microbiology and Biomanufacturing期刊主编，Bioresouce and Bioprocess、微生物学报、食品生物技术等多本学术期刊编委。

徐岩教授主要从事酿造科学与工业酶学领域科学研究，通过在酿造发酵过程中群体微生物结构与功能、微生物及其代谢机理、微生物新酶及其分子改造等研究工作，从基因组学、蛋白组学和代谢组学的水平上，解析微生物发酵机制、探索微生物酶蛋白的结构与催化功能的相互关系，提升和改造传统发酵工艺，采用发酵技术和酶技术发掘和延展新的生物制造过程，满足工业生物制造的需求。

徐岩教授先后主持国家十三五重点研发计划项目、“973计划”、“863 计划”、国家科技支撑计划、国家自然科学基金（重点项目）等国家级重大科研项目18项。发表高水平SCI论文270余篇（TOP级期刊论文82篇），申请国家发明专利150余项（其中国际专利11项），授权90余项（其中国际专利9项）。在传统发酵工程领域，针对中国传统酿造等相关产业的技术水平，形成的风味导向学术思想，成果辐射全国，推动了产业的改造。在包括茅台、五粮液、洋河等40余家全国知名白酒企业实现科技成果转化。在食品生物技术领域，开发的高效安全焙烤专用脂肪酶打破国际垄断，实现在3家企业产业化规模发酵制备与应用效果显著。研究成果以第一完成人荣获国家技术发明二等奖，中国专利银奖、中国轻工业联合会技术进步奖一等奖，中国商业联合会科学技术奖特等奖等国家级及省部级奖励13项。

范文来，男，江南大学研究员，饮料酒现代风味化学创始人，“风味导向技术”发明人，国家发明二等奖主要获得者，美国俄勒冈州立大学作访问学者，中国化学会高级会员，中国微生物会永久会员，美国化学会（ACS）会员，全国酿酒标准化委员会（SAT/TC）委员，中国材料与试验标准化委员会（CSTM）委员，国家市场监管重点实验室（白酒监管）技术委员会副主任，中国酿酒原料及品质安全研究院副院长。

长期致力于酿酒工程、酒类风味化学、饮料酒品质与安全、副产物高值化利用等研究，发表各类论文200余篇，其中在国际知名杂志如 Compr. Rev. Food Sci. Safe（食品科学与食品安全综述）、JAFC（美国农化）、Food Chem.（欧洲食品化学）等发表SCI论文50余篇，单篇引用超过536次（google 学术），出版中文专著5部（《饮料酒风味及其分析技术》、《酒类风味化学》主编、《白酒生态发酵与智能化酿造》、《白酒品评与勾兑》》、《技术创新推动中国白酒高质量发展》副主编），教材3部（《蒸馏酒工艺学》、《酒类风味化学》主编、《酿酒分析与检测》副主编），译著1部（《风味，香气和气味分析》）。

近年来主持或参与完成十三五/十四五国家重点专项、国家863计划、国家自然科学基金/重点基金、十一五/十二五国家科技支撑计划等项目7项；获授权发明专利近30项，30项科研成果被鉴定达到“国际先进”或“领先水平”；1项科研成果获得国家技术发明二等奖、1项成果获全国商业科技进步特等奖、4项科研成果获省部级科技进步一等奖、多项成果获省部级二、三等奖。

杨 亮，博士，贵州省“千”层次人才，国家一级品酒师，茅台学院酿酒工程系副教授，白酒酿造工程教研室副主任。长期从事酿造微生物及白酒风味相关研究。主持国家自然科学基金（2项）、贵州省科技计划基础研究项目、江苏省（博士）研究生科研创新计划、贵州省教育厅科技拔尖人才等基金项目9项，以第一作者在Compr. Rev. Food Sci. Safe、Food Chem., Food Microbiol、Food Res. Int.、Front. Microbiol.、Food Biosci.、LWT-Food Sci. Technol.等SCI及核心期刊发表论文十余篇，授权发明专利1项。研究成果以第一完成人荣获中国贵州茅台酒厂（集团）有限责任公司科技创新成果奖二等奖、三等奖各一次，荣获茅台集团金牌员工、茅台学院科研先进个人。

LECO技术简介：

美国力可公司（LECO）成立于1936年，Laborotary Equipment Corporation一直致力于实验室分析仪器开发，并在全球设有25家子公司的跨国企业。力可公司自1936年推出世界上第一台商品化的CSONH元素分析仪以来，一直保持着在工业分析领域的领先地位，国内已服务上万家用户。质谱领域：第一家商业化气相色谱—飞行时间质谱联用仪GC-TOFMS，‍‍‍‍第一家商业化全二维气相色谱—飞‍‍行时间质谱GCxGC-TOFMS‍‍，‍第一家商业化高分辨高通量多反射飞行时间质谱GC-HRT，公司不仅拥有大量首创技术专利和先进的生产设备，十分注重产品质量和技术创新。此外，力可公司还非常重视中国市场的发展和潜力，为广大用户提供先进优质的科技产品及方法学服务。

常规一维流出峰经调制后得到的二维峰峰宽是非常窄的，对于复杂样品，0.1s的峰宽，至少需要200 谱图每秒的采集速率才可以完整定义峰信息，而常规低速率的四级杆和轨道阱等扫描式质谱是远远不够的。

下图红色框内是一维色谱严重共流出区域，在短短10s内，GCxGC-TOF共识别出9个化合物，每个痕量化合物的谱库匹配率很高900/1000，定性结果都非常可靠。

此外，LECO软件强大的解卷积功能，使得常规一维色谱共流出的每个化合物都得以清晰识别和准确定性。

上图全二维色谱依然共流出的四分析物的准确定性，下图解卷积保证四分析物真实干净的质谱图，大大提高谱库匹配率。样品来源：中国领先风味组学用户真实食品样品

没有久经考验的飞行时间质谱TOF联用来保证定性准确率和定量可靠性，组装的全二维色谱GCxGC给出的也可能是垃圾数据，干扰科学家获取真实信息。

此外，针对不同的分析应用目的，不论是靶向分析还是非靶向分析，单个样品还是批量样品，Chroma TOF软件均开发了系统完整的软件功能。在单个样品经典的Reference比较功能之外，LECO推出了两款功能强大的大队列组学分析软件：Tile和Sync。特别适合用于计量统计学、生物信息学批量数据分析。科学家再也不必依赖于第三方组学服务平台。

Tile软件侧重于样本间全二维差异性分析，Sync软件适用于组学批量数据的峰对齐和差异分析。

Sync软件展示：

Tile软件展示：

译：Vera，Gary