苯丙氨酸解氨酶(PAL)检测试剂盒(苯丙氨酸微板法)实验操作
苯丙氨酸解氨酶(PAL)检测试剂盒(苯丙氨酸微板法)
产品简介：
苯丙氨酸解氨酶(L- phenylalanine ammonia-lyase，PAL)是催化直接脱掉L-苯丙氨酸上的氨而生成反式桂皮酸的酶，该酶多存在于高等植物、酵母、菌类可溶性部分物质，是1961年J.Koukol在大麦中发现的，推测其分子量约为30万，这是一个可把苯丙氨酸用于酚类化合物合成的酶。在组织中的活性可随外界因素而发生显著变化，用光照、病伤害、植物激素处理等会使活性显著增加，在多数情况下在组织中活性增加时，酶发生失活作用，这时组织中具有活性酶的量很快就会减少，据认为这种失活是与类蛋白质物质作用有关，测定细胞木质素合成途径中间代谢物及关键酶活性,可以探讨多种生物细胞发育过程中木质素沉积的代谢机理，为减少水果石细胞含量提高其品质提供依据。
雅吉生物苯丙氨酸解氨酶(PAL)检测试剂盒(苯丙氨酸微板法)检测原理是以苯丙氨酸作为底物，在酶促反应的最适条件下采用每隔一定时间测定产物生成量的方法，于酶标仪290nm 处检测吸光度，以吸光度变化所需酶量进行计算，主要用于植物组织的裂解液或匀浆液、血清等样品中内源性的苯丙氨酸解氨酶活性,尤其适用于检测水果中苯丙氨酸解氨酶活性。
该试剂盒仅用于科研领域，不适用于临床诊断或其他用途。
产品组成：
名称 | 100T | Storage |
试剂(A):PAL Lysis Buffer | 250ml | 4℃避光 |
试剂(B):PAL Assay Buffer | 5ml | 4℃避光 |
试剂(C):PAL终止液 | 1.2ml | RT |
自备材料：
1、蒸馏水
2、电子天平、研钵或匀浆器、离心管或试管
3、低温离心机、恒温箱或水浴锅、酶标仪、酶标板
操作步骤(仅供参考)：
1、准备样品∶
①植物样品︰取1g植物组织或水果中层果肉，加入2.5ml PAL Lysis Buffer，冰浴情况下充分捣碎研磨或匀浆，4℃ 10000r/min离心15~20min，留取上清液，-20℃冻存，用于苯丙氨酸解氨酶的检测。
②血浆、血清和尿液样品︰血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于该试剂盒的测定，-20℃冻存，用于苯丙氨酸解氨酶的检测。
③细胞或组织样品∶取恰当细胞或组织裂解液，如果有必要需进行适当匀浆，4℃ 10000r/min离心15~20min，取上清液，-20℃冻存，用于苯丙氨酸解氨酶的检测。④高活性样品︰如果样品中含有较高活性的苯丙氨酸解氨酶，可以使用蒸馏水或PAL Lysis Buffer稀释进行恰当的稀释。
2、PAL加样∶
取96孔板，按照下表设置对照孔、测定孔，溶液应按照顺序依次加入，并
注意避免产生气泡。如果样品中的PAL活性过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定，样品的检测最好能设置2平行孔，求平均值。
加入物（μl） | 对照孔 | 测定孔 |
蒸馏水 | 150 | 100 |
待测样本 | 50 | 50 |
PAL Assay Buffer | - | 50 |
3、PAL检测︰
以对照孔为对照(调零)，酶标仪立即测定290nm处测定孔的吸光度(记为 A测定0);40℃准确孵育1h，立即加入10μl PAL终止液终止反应(备选方案)，以对照孔为对照调零，酶标仪立即测定290nm处测定孔的吸光度(记为A测定1)。
注意︰加入PAL终止液终止反应为非必须步骤，可37℃准确孵育1h后直接以对照孔为对照调零，酶标仪立即测定290nm处测定孔的吸光度。
计算:
PAL活性单位的定义︰在该实验条件下，每小时吸光度变化0.01所需酶量为一个活性单位。
组织样品PAL(U)={(A测定1-A测定0)×VT}/(W×Vs×0.01×t)
液体样品PAL(U)=(A测定1-A测定0)/(0.01×t)
式中:
A测定1=40℃孵育1h后测定孔的吸光度
A测定0=加入PAL Assay buffer后立即检测的测定管吸光度
W=组织样本的重量(g)
VT=提取酶液的总体积(ml)
Vs=测定时所用酶液体积(ml)
t=反应时间(h)=1
注意事项∶
1、待测样品中不能含有酶抑制剂，同时需避免反复冻融。
2、获得上清液为PAL酶液，应尽快检测，亦可-20°℃保存。
3、如果没有可测定紫外区的酶标仪和酶标板，也可以使用紫外分光光度计和石英比色皿，但应注意比色杯的最小检测体积。
4、每次检测指标不宜过多，否则操作时间不一，有可能导致样本间的差异。5、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
有效期:6个月有效，4℃运输，4℃保存。
来源于：上海雅吉生物科技有限公司
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