SPE/HPLC方法法测定奶粉中香兰素
张景然，岳中花，乔艳芬（博纳艾杰尔应用部）
1. 前言
香兰素亦称香草素、香草醛等，学名为3-甲氧基-4-羟基苯甲醛，根据欧盟专家委员会2000年2月24日报道，大剂量可导致头痛，恶心，呕吐，呼吸困难，甚至损伤肝肾功能。
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样品组分
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结构式
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香兰素
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中华人民共和国国家标准《食品添加剂使用标准》（GB2760-2011）规定，较大婴儿和幼儿配方食品中香兰素最大使用量为5mg/100mL，其中100mL以即食食品计，生产企业应按照冲调比例折算成配方食品中的使用量；婴幼儿谷类辅助食品中可以使用香兰素，最大使用量为7mg/100g，其中100g以即食食品计；凡使用范围涵盖0至6个月婴幼儿配方食品不得添加任何食用香料。
国家标准中只规定了限值，未有检测方法。本实验使用天津博纳艾杰尔科技有限公司的Cleanert® PAX固相萃取小柱和Venusil® XBP C18（L）液相色谱柱，建立了一种奶粉中香兰素的检测方法，经实验验证，该方法简单、快速、准确度高。
2. 实验方法
2.1实验试剂和耗材
l 水 (pH=4.5)；取100mL水，用乙酸调节pH至4.5；
l 2%乙酸铅溶液：称取乙酸铅2g，加水稀释并定容至100mL；
l 5%氨水溶液：取氨水溶液5mL，加水稀释并定容至100mL；
l 5%酸化甲醇：取甲酸5mL，加甲醇95mL混匀；
l 香兰素储备液 (1mg/mL)：准确称取香兰素标准品10mg，加水稀释并定容至10mL；
l SPE柱：Cleanert® PAX (60mg/3mL)，使用前分别用3mL甲醇和3mL水活化；
l HPLC柱：Venusil® XBP C18 (L) (5μm 150Å 4.6*150mm)；
l 针式过滤器：亲水型 PTFE (0.45μm，13mm)。
2.2 仪器及设备
l LC-10F高效液相色谱系统；
l Qdaura®卓睿全自动固相萃取仪；
l 高速离心机 (转子50mL*6)；
l 氮吹仪；
l 12位固相萃取装置。
2.3试样处理
准确称取奶粉试样1g（精确至0.01g）于50mL离心管中，加入pH=4.5的水溶液5mL，混匀超声提取5min，加2%乙酸铅溶液2mL，混匀后静置2min，8000r/min离心10min；取上清液用5%氨水溶液调节pH至中性；将上清液全部加样至活化好的Cleanert® PAX小柱，然后分别用3mL 5%氨水溶液和3mL甲醇淋洗小柱，弃去淋洗液；用3mL 5%酸化甲醇洗脱（以上固相萃取操作通过Qdaura®卓睿全自动固相萃取仪完成），收集洗脱液于30℃下氮气吹干，用1mL流动相重新溶解，过滤，待测。
2.4液相色谱条件
色谱柱：Venusil® XBP-C18（L），5um 150Å 4.6*150mm；
流动相：A（0.02mol/L的磷酸二氢钾溶液，磷酸调节pH=4.0）：B（乙腈）= 90：10；
流 速：1.0mL/min；进样量：20μL；波 长：276nm；柱温：30℃。
3. 实验结果
3.1线性关系和检出限
量取一定量香兰素标准储备液，分别用水稀释至1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、25μg/mL和50μg/mL，按照3.3检测条件依次进样，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，拟合标准曲线方程，结果见表1：
表1 香兰素标准曲线和检出限
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标准曲线方程
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相关系数
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检出限（S/N>3）
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Y=86.443X+36.907
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0.9998
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1μg/g
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3.2准确度
表2. 5μg/g添加回收实验结果
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平行1
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平行2
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平行3
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平均回收率
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RSD
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回收率
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89.03%
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94.30%
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90.67%
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91.33%
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2.70%
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表3. 25μg/g添加回收实验结果
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平行1
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平行2
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平行3
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平均回收率
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RSD
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回收率
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85.08%
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87.85%
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83.59%
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85.51%
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2.16%
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4. 实验结论
实验表明，Cleanert® PAX和Venusil® XBP C18（L）可以用于奶粉中香兰素的检测，本方法简单、快速、准确度高。
5. 实验图谱
图1 奶粉空白谱图
图2. 5μg/g添加谱图
图3. 1μg/g标准溶液谱图
6. 订货信息
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名称
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规格
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订货号
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分析型高效液相色谱仪
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10ml/min，等度系统，200-400nm双波长检测器
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FL-LC010
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分析型色谱柱温箱
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室温+5-50℃，箱内两对夹套
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CC-100-T
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Qdaura® 卓睿全自动固相萃取系统
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4通道
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SPE-40
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甲醇
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色谱纯，4*4L/箱
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AH230-4
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乙腈
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色谱纯，4*4L/箱
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AH015-4
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Cleanert® PAX SPE柱
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60mg/3ml，50支/盒
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AX0603
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Venusil® XBP C18（L）HPLC柱
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5μm 150Å 4.6*150mm
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VX952505-L
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保护柱芯
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4.6*10mm，4/包
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VX950105-L
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保护柱套
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适用于4.6*10mm的保护柱芯
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CH-100
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亲水PTFE针式过滤器
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0.45μm，13mm，100/包
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AS081345
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一次性注射器
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2ml无针头，100支/包
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LZSQ-2ML
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溶剂过滤器
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1L
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AM3100
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1.5mL样品瓶
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短螺纹透明带书写处，100/PK
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1109-0519
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1.5mL样品瓶盖
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100/PK
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0915-1819
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12样品瓶
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螺纹透明，100/PK
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1509-1657
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12mL样品瓶盖
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100/PK
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1515-1748
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微孔滤膜（MCM）
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50mm，0.45μm，100片/包
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AM015045
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微孔滤膜（Nylon）
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50mm，0.45μm，100片/包
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AM025045
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离心机
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最大转速10000r/min
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TGL-10B
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氮吹仪
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15位
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NV15-G
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真空固相萃取缸
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12位
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VM12
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流速调节阀
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12个/包
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A81213
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穿板导流针
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12个/包
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A80100
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无油隔膜真空泵
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1台
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A01003
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来源于：博纳艾杰尔科技
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