使用超高效合相色谱分析短杆菌肽
使用超高效合相色谱(UPC2)分析短杆菌肽
Sean M. McCarthy, Andrew J. Aubin, 和 Michael D. Jones
沃特世公司(美国马萨诸塞州米尔福德)
应用效益
■ 快速分离短杆菌肽
■ 载量线性响应
■ 准确、高精度分析短杆菌肽的方法
■ 有可能用于其它疏水性肽和蛋白质
沃特世解决方案
ACQUITY UPC2系统
ACQUITY® SQD
ACQUITY UPC2 CSH氟苯基色谱柱
Empower™ 3软件
关键词
超高效合相色谱、UPC2、疏水性肽、短杆菌肽
简介
用反相液相色谱(RPLC)分析疏水性肽和蛋白质难度很大，因为溶液中经常需要使用洗涤剂保持疏水性物质的稳定性，而这些洗涤剂容易发生聚集和/或沉淀，严重影响它们的回收，这些因素以及其它原因使得难以用RPLC分离疏水性肽和蛋白质。
在本应用纪要中，我们为您介绍一种在ACQUITY UPC2TM系统上使用沃特世(Waters®)超高效合相色谱技术分离典型跨膜肽-短杆菌肽的方法。
短杆菌肽是由芽孢杆菌产生的一种常见和已被良好表征的跨膜肽物质，它被用作对抗革兰氏阳性和某些革兰氏阴性细菌的局部用抗生素，短杆菌肽包括通用组成为甲酰-L-缬氨酸-甘氨酸-L-丙氨酸-D-亮氨酸-L-丙氨酸-D-缬氨酸-L-缬氨酸-D-缬氨酸-L-色氨酸-D-亮氨酸-L-X-D-亮氨酸-L-色氨酸-D-亮氨酸-L-色氨酸-氨基乙醇的一族化合物，其中X取决于短杆菌肽分子，即分别占总短杆菌肽量约87.5%、7.1%和5.1%的革兰氏A(X=色氨酸)、革兰氏B(X=苯丙氨酸)和革兰氏C(X=酪氨酸)，1需要交替的D和L氨基酸单元构成_-螺旋状。
我们研究了色谱柱化学品、流动相改性剂和梯度斜率对分离短杆菌肽的影响。采用优化方法分离市场上销售的非处方药物(OTC)，将测定的短杆菌肽浓度与标示量进行对比。采用质谱仪测定短杆菌肽的浓度，采用选择离子谱表征每种物质。在ACQUITY UPC2系统上使用我们的方法，可得到线性和可重复的结果——测定的OTC制剂浓度为标示量的98.4%。
试验
测试条件
除非另有说明，以下是用于所有色谱最终方法的最佳条件。
UPC2测试条件
UPC2系统: ACQUITY UPC2
检测器： PDA、ACQUITY SQD PDA @ 280nm,分辨率为6 nm(补偿400至500 nm)
色谱柱： ACQUITY UPC2 CSH 氟苯基,3.0 x 100 mm, 1.7 μm
柱温： 50 °C
样品温度： 15 °C
UPC2 ABPR: 1885 psi
进样量： 1 μL
流速： 2.0 mL/min
流动相A： CO2
流动相B： 含0.1%TFA的甲醇(除非另有标示)
梯度： 20%至30% B，1.5min
SQD条件
离子源： ES+
锥孔电压： 20 V
毛细管电压： 3.7kV
源温度： 150 °C
脱溶剂气温度： 500 °C
脱溶剂气体流速： 400 L/hr
锥孔气体流速： 25 L/hr
SIR: 922.6,930.3,941.9
数据管理
Empower 3软件
样品描述
用解硫胺素芽孢杆菌(短芽孢杆菌)制备的短杆菌肽从Sigma Aldrich公司购买，将样品溶解在甲醇中制成0.5mg/mL浓度的溶液，如需要，可用甲醇稀释。含有短杆菌肽的非处方软膏是从当地药店购买的。将0.2g软膏溶解在10mL正己烷中，然后用5mL甲醇萃取短杆菌肽，去除甲醇层，用0.2-μm的烧结玻璃盘过滤，然后直接进样ACQUITY UPC2系统。
结果与讨论
我们系统性地筛选了四种色谱柱，测定哪种分离效果最佳，结果如图1所示，色谱柱筛选过程可在1小时内非常快速地完成。在我们设定的筛选条件下，BEH 2-EP和BEH色谱柱未检测到谱峰，由于其它色谱柱表现出合适的色谱性能，因而未对这两者的非洗脱原因深入研究，其中ACQUITY UPC2 CSH氟苯基色谱柱检测的色谱峰形最佳，因此采用该色谱柱继续研究。
图1.通过短杆菌肽标准物的色谱峰形和保留时间筛选各种化学特性色谱柱。所有色谱柱规格为3.0x100mm，填装亚-2-微米填料；所有分离条件都采用流动相A：CO2、流动相B、含0.1% FA的MeOH、2 mL/min, 3%B至25% B，5min。
为了分离短杆菌肽物质，对酸性改性剂的影响进行了研究，结果表明：使用三氟乙酸(TFA)可得到稍好的峰形，提高了短杆菌肽A和短杆菌肽C之间的分离度，结果如图2所示。已知TFA会抑制质谱电离，但每种物质的信号都足以定量检测治疗制剂，后续将对此进行讨论。对于要求更高灵敏度的应用，可能需要降低TFA浓度或使用甲酸，以达到希望的检测限值。
图2.酸性改性剂对分离短杆菌肽的影响。
当设置好合适色谱条件后，通过减少梯度时间优化分离过程，结果如图3所示，我们能够在1.5分钟时间内使每种短杆菌肽组分的分离度达到1.4或更高，在相同流速下通过减少运行时间增加梯度斜率，不但实现有效分离，同时还将短杆菌肽A的信噪比从336提高至605。
图3.UV 280-nm痕量检测优化分离短杆菌肽A、B和C。
我们测试了最佳分离条件，能够使用单四极杆质谱(SQD)检测每种物质，图4显示：每种物质都被质谱良好分离和检测到，另外每种短杆菌肽物质都显示含有绝大多数的M+2H离子，后续的研究将使用这些参数进行选择离子监测。
图4：每种短杆菌肽物质的总离子图谱-A和加合离子图谱-B-D。选择强度最高的离子评估市场上销售的抗菌制剂中的短杆菌肽含量，对于多肽序列，红色残基是L型同分异构体，黑色残基是D型同分异构体。
为了评估我们的方法是否适用于定量分析市场上销售的非处方药中的短杆菌肽，我们在ACQUITY SQD上使用选择离子监测，结果如图5A所示。我们绘制浓度-峰面积曲线，得到每种物质的校正曲线。结果发现：如图5B-D所示，每种成分在测试范围内都呈线性响应。另外还使用校正曲线测定了非处方药物中的每种短杆菌肽物质浓度。
图5，图A-25.0、12.5、1.25和0.625mg/mL浓度的标准溶液中含有短杆菌肽物质的叠加选择离子谱。图B、C和D-每种短杆菌肽A、B和C各自的MS峰面积线性拟合图。
使用开发的方法评估非处方药物中的短杆菌肽物质的浓度和相对丰度。如图6所示，重复分析结果表明：每种短杆菌肽%RSD值小，计算浓度与标签上的标称值相吻合；我们还发现短杆菌肽物质的相对丰度与文献报道的丰度非常吻合1。
图6. 从抗菌软膏中萃取的短杆菌肽A、B和C的叠加选择离子谱重复进样分析的计算RSD值(N=3)在可接受限值以内，计算丰度与文献报道数值非常吻合1。
结论
正如本应用纪要所展示的，ACQUITY UPC2系统与ACQUITYUPC2色谱柱化学结合使用，可为短杆菌肽提供简单、准确和可重现的分析方法。该工作表明ACQUITY UPC2系统可用于分析疏水性肽，还可能用于分析疏水性蛋白质，例如膜蛋白。
参考文献
1. The Merck Index and Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals.13th ed. Whitehouse Station, NJ : Merck Research Laboratories; 2001.
关于沃特世公司(www.waters.com)
50多年来，沃特世公司(NYSE:WAT)通过提供实用和可持续的创新，使医疗服务、环境管理、食品安全和全球水质监测领域有了显著进步，从而为实验室相关机构创造了业务优势。
作为一系列分离科学、实验室信息管理、质谱分析和热分析技术的开创者，沃特世技术的重大突破和实验室解决方案为客户的成功创造了持久的平台。
2010年沃特世拥有16.4亿美元的收入和5,400名员工，它将继续带领全世界的客户探索科学并取得卓越成就。
联系人：
叶晓晨
沃特世科技（上海）有限公司 市场服务部
xiao_chen_ye@waters.com
周瑞琳(GraceChow)
泰信策略(PMC)
020-83569288
13602845427
grace.chow@pmc.com.cn
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■ 有可能用于其它疏水性肽和蛋白质
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关键词
超高效合相色谱、UPC2、疏水性肽、短杆菌肽
简介
用反相液相色谱(RPLC)分析疏水性肽和蛋白质难度很大，因为溶液中经常需要使用洗涤剂保持疏水性物质的稳定性，而这些洗涤剂容易发生聚集和/或沉淀，严重影响它们的回收，这些因素以及其它原因使得难以用RPLC分离疏水性肽和蛋白质。
在本应用纪要中，我们为您介绍一种在ACQUITY UPC2TM系统上使用沃特世(Waters®)超高效合相色谱技术分离典型跨膜肽-短杆菌肽的方法。
短杆菌肽是由芽孢杆菌产生的一种常见和已被良好表征的跨膜肽物质，它被用作对抗革兰氏阳性和某些革兰氏阴性细菌的局部用抗生素，短杆菌肽包括通用组成为甲酰-L-缬氨酸-甘氨酸-L-丙氨酸-D-亮氨酸-L-丙氨酸-D-缬氨酸-L-缬氨酸-D-缬氨酸-L-色氨酸-D-亮氨酸-L-X-D-亮氨酸-L-色氨酸-D-亮氨酸-L-色氨酸-氨基乙醇的一族化合物，其中X取决于短杆菌肽分子，即分别占总短杆菌肽量约87.5%、7.1%和5.1%的革兰氏A(X=色氨酸)、革兰氏B(X=苯丙氨酸)和革兰氏C(X=酪氨酸)，1需要交替的D和L氨基酸单元构成_-螺旋状。
我们研究了色谱柱化学品、流动相改性剂和梯度斜率对分离短杆菌肽的影响。采用优化方法分离市场上销售的非处方药物(OTC)，将测定的短杆菌肽浓度与标示量进行对比。采用质谱仪测定短杆菌肽的浓度，采用选择离子谱表征每种物质。在ACQUITY UPC2系统上使用我们的方法，可得到线性和可重复的结果——测定的OTC制剂浓度为标示量的98.4%。
试验
测试条件
除非另有说明，以下是用于所有色谱最终方法的最佳条件。
UPC2测试条件
UPC2系统: ACQUITY UPC2
检测器： PDA、ACQUITY SQD PDA @ 280nm,分辨率为6 nm(补偿400至500 nm)
色谱柱： ACQUITY UPC2 CSH 氟苯基,3.0 x 100 mm, 1.7 μm
柱温： 50 °C
样品温度： 15 °C
UPC2 ABPR: 1885 psi
进样量： 1 μL
流速： 2.0 mL/min
流动相A： CO2
流动相B： 含0.1%TFA的甲醇(除非另有标示)
梯度： 20%至30% B，1.5min
SQD条件
离子源： ES+
锥孔电压： 20 V
毛细管电压： 3.7kV
源温度： 150 °C
脱溶剂气温度： 500 °C
脱溶剂气体流速： 400 L/hr
锥孔气体流速： 25 L/hr
SIR: 922.6,930.3,941.9
数据管理
Empower 3软件
样品描述
用解硫胺素芽孢杆菌(短芽孢杆菌)制备的短杆菌肽从Sigma Aldrich公司购买，将样品溶解在甲醇中制成0.5mg/mL浓度的溶液，如需要，可用甲醇稀释。含有短杆菌肽的非处方软膏是从当地药店购买的。将0.2g软膏溶解在10mL正己烷中，然后用5mL甲醇萃取短杆菌肽，去除甲醇层，用0.2-μm的烧结玻璃盘过滤，然后直接进样ACQUITY UPC2系统。
结果与讨论
我们系统性地筛选了四种色谱柱，测定哪种分离效果最佳，结果如图1所示，色谱柱筛选过程可在1小时内非常快速地完成。在我们设定的筛选条件下，BEH 2-EP和BEH色谱柱未检测到谱峰，由于其它色谱柱表现出合适的色谱性能，因而未对这两者的非洗脱原因深入研究，其中ACQUITY UPC2 CSH氟苯基色谱柱检测的色谱峰形最佳，因此采用该色谱柱继续研究。
图1.通过短杆菌肽标准物的色谱峰形和保留时间筛选各种化学特性色谱柱。所有色谱柱规格为3.0x100mm，填装亚-2-微米填料；所有分离条件都采用流动相A：CO2、流动相B、含0.1% FA的MeOH、2 mL/min, 3%B至25% B，5min。
为了分离短杆菌肽物质，对酸性改性剂的影响进行了研究，结果表明：使用三氟乙酸(TFA)可得到稍好的峰形，提高了短杆菌肽A和短杆菌肽C之间的分离度，结果如图2所示。已知TFA会抑制质谱电离，但每种物质的信号都足以定量检测治疗制剂，后续将对此进行讨论。对于要求更高灵敏度的应用，可能需要降低TFA浓度或使用甲酸，以达到希望的检测限值。
图2.酸性改性剂对分离短杆菌肽的影响。
当设置好合适色谱条件后，通过减少梯度时间优化分离过程，结果如图3所示，我们能够在1.5分钟时间内使每种短杆菌肽组分的分离度达到1.4或更高，在相同流速下通过减少运行时间增加梯度斜率，不但实现有效分离，同时还将短杆菌肽A的信噪比从336提高至605。
图3.UV 280-nm痕量检测优化分离短杆菌肽A、B和C。
我们测试了最佳分离条件，能够使用单四极杆质谱(SQD)检测每种物质，图4显示：每种物质都被质谱良好分离和检测到，另外每种短杆菌肽物质都显示含有绝大多数的M+2H离子，后续的研究将使用这些参数进行选择离子监测。
图4：每种短杆菌肽物质的总离子图谱-A和加合离子图谱-B-D。选择强度最高的离子评估市场上销售的抗菌制剂中的短杆菌肽含量，对于多肽序列，红色残基是L型同分异构体，黑色残基是D型同分异构体。
为了评估我们的方法是否适用于定量分析市场上销售的非处方药中的短杆菌肽，我们在ACQUITY SQD上使用选择离子监测，结果如图5A所示。我们绘制浓度-峰面积曲线，得到每种物质的校正曲线。结果发现：如图5B-D所示，每种成分在测试范围内都呈线性响应。另外还使用校正曲线测定了非处方药物中的每种短杆菌肽物质浓度。
图5，图A-25.0、12.5、1.25和0.625mg/mL浓度的标准溶液中含有短杆菌肽物质的叠加选择离子谱。图B、C和D-每种短杆菌肽A、B和C各自的MS峰面积线性拟合图。
使用开发的方法评估非处方药物中的短杆菌肽物质的浓度和相对丰度。如图6所示，重复分析结果表明：每种短杆菌肽%RSD值小，计算浓度与标签上的标称值相吻合；我们还发现短杆菌肽物质的相对丰度与文献报道的丰度非常吻合1。
图6. 从抗菌软膏中萃取的短杆菌肽A、B和C的叠加选择离子谱重复进样分析的计算RSD值(N=3)在可接受限值以内，计算丰度与文献报道数值非常吻合1。
结论
正如本应用纪要所展示的，ACQUITY UPC2系统与ACQUITYUPC2色谱柱化学结合使用，可为短杆菌肽提供简单、准确和可重现的分析方法。该工作表明ACQUITY UPC2系统可用于分析疏水性肽，还可能用于分析疏水性蛋白质，例如膜蛋白。
参考文献
1. The Merck Index and Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals.13th ed. Whitehouse Station, NJ : Merck Research Laboratories; 2001.
关于沃特世公司(www.waters.com)
50多年来，沃特世公司(NYSE:WAT)通过提供实用和可持续的创新，使医疗服务、环境管理、食品安全和全球水质监测领域有了显著进步，从而为实验室相关机构创造了业务优势。
作为一系列分离科学、实验室信息管理、质谱分析和热分析技术的开创者，沃特世技术的重大突破和实验室解决方案为客户的成功创造了持久的平台。
2010年沃特世拥有16.4亿美元的收入和5,400名员工，它将继续带领全世界的客户探索科学并取得卓越成就。
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叶晓晨
沃特世科技（上海）有限公司 市场服务部
xiao_chen_ye@waters.com
周瑞琳(GraceChow)
泰信策略(PMC)
020-83569288
13602845427
grace.chow@pmc.com.cn
来源于：沃特世科技（上海）有限公司(Waters)
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