“检测直通车”之乳品中双氰胺的检测——金域检验

　　我要测讯 2013年1月25日，有媒体爆出新西兰牛奶中发现了有毒物质—双氰胺，可能会对该国总额11亿纽元(约合人民币57亿元)的乳品行业造成打击。据了解，新西兰农民在牧场使用双氰胺主要用以防止硝酸盐等流入河流造成污染。在新西兰1.2万个牧场中，约有500家使用双氰胺。而双氰胺的在食品中检出的相关国际和国家标准尚无。

　　双氰胺又名二氰二氨、二聚氰胺，缩写DICY或DCD，白色结晶粉末。主要用作三聚氰胺的原料、染料固色剂、化肥、精细化工中间体等。由于无相关标准可循，双氰胺的检测并未作为食品的必检项目，检测方法方面，查询相关文献报道了解到，目前的检测方法主要有高效液相色谱质谱法、高效液相法、分光光度法等。

　　自事件发生后，相关检测实验室对事件做出积极响应，根据自身具备的条件，快速开发出双氰胺的检测方法，如广州金域检验中心，方法如下：

奶粉中双氰胺的检测方法(UPLC-MS/MS法)

　　一、实验原理

　　样品经水浸泡并混匀，加入乙腈沉淀蛋白，通过冷冻离心去除脂肪，取清液经过固相萃取SPE小柱净化，氮气浓缩至干，后用1.00 mL 50%乙腈水溶液复溶，过滤膜上UPLC-MS/MS测定。采用电喷雾正离子电离(ESI + )模式和多反应监控(MRM) 扫描模式，外标法定量。该方法在5ng/ml ～ 500ng /ml范围内线性关系良好，相关系数(r2 )大于0. 999。

　　二、仪器和试剂

　　超高效液相色谱串联质谱联用仪(UPLC-MS/MS)，涡旋振荡器，超声波清洗机，氮吹仪。双氰胺标准品，固相萃取SPE小柱，Venusil HILIC液相色谱柱，微孔滤膜，乙酸铵、甲酸、乙酸、乙腈为色谱纯，实验用水为超纯水。

　　三、实验方法

　　1.提取、净化

　　称取2.5g试样于50ml具塞离心管中，准确加入5ml水浸泡溶解后，准确加入乙腈20ml，振荡混匀，超声10min，5500r/min冷冻离心5min，取5ml上清液过固相萃取SPE小柱净化，氮气浓缩至干，后用1.00 mL 50%乙腈水溶液复溶，过0.22um滤膜上UPLC-MS/MS测定。

　　2.图文详解

　　①称取奶粉样品1.00g于50mL具塞离心管中，涡旋振荡混匀

　　②目标物提取和离心

　　③固相萃取净化

　　④氮吹浓缩

　　⑤溶解定容

　　⑥上机测定

　　3.仪器参数

　　3.1色谱条件：

　　色谱柱：Agilent HILIC puls 3.5μm 2.1*100mm;

　　流动相：A：2mmol/L乙酸铵(pH=4.0)

　　B：乙腈

　　A：B=10:90

　　进样量：2ul;

　　柱温：30℃;

　　流速：0.3 ml/min。

　　3.2质谱条件

　　液相色谱串联质谱联用仪：Agilent UPLC 1290 & QQQ 6460;

　　离子源：电喷雾离子源;

　　扫描方式：正离子扫描;

　　检测方式：多反应监测MRM;

　　干燥气温度(Gas Temp)325℃;干燥气流量(Gas Flow)5mL/min，雾化器压力(Nebulizer)50psi，鞘流气温度(Sheath Gas Temp)400℃，鞘流气流量(Sheath Gas Flow)12mL/min，毛细管电压(Capillary)3500(+)V，MRM条件：双氰胺85.2>68.1(CE=19eV)，85.2>43.0(CE=21eV);

　　4.实验结果

　　4.1线性关系和检出限

　　准确称取双氰胺标准品50mg于50ml容量瓶中，加水溶液并稀释至刻度，作为标准贮备液;

　　分别量取一定量的标准贮备液，用乙腈稀释，配置成浓度为5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，50ng/ml，100ng/ml和500ng/ml的标准溶液，按照上述液质方法，结果见下表1：

表1 双氰胺线性方程和定量限(UPLC-MS/MS法)

　　4.2检测方法稳定性考察

　　选用50.0ng/ml的标准溶液连续进样6针，计算其保留时间和峰面积的RSD值，结果见表2：

表2 检测方法定性和定量稳定性考察考察(UPLC-MS/MS法)

标号	保留时间，min	峰面积
1	1.15	382950
2	1.16	387950
3	1.17	382840
4	1.15	399820
5	1.18	378580
6	1.19	383810
RSD，%	0.65	1.92

　　4.3.准确度和精密度

　　选取市售某品牌奶粉试样，进行添加回收实验，结果见表3。采用空白样品稀释法判断检测方法的基质效应影响。空白净化液稀释和乙腈稀释的标准溶液，双氰胺峰面积和相对丰度比无明显变化，故判断该方法无基质效应的影响。

表3 0.10mg/Kg添加回收实验结果

平行1，%	平行2，%	平行3，%	平均值，%	RSD，%
84.6	80.7	90.2	85.2	5.61

　　5 检出限

　　本方法仪器最低检测浓度5ng/mL，按照上述样品前处理计算，本方法检出限0.01mg/kg。未检出样品以<0.01mg/kg报值。

　　附：广州金域检验中心

　　金域检验创立于1994年，总部位于广州。是中国最早获得《医疗机构执业许可证》的独立实验室和进入医学检测服务领域的企业之一。业务范围涵盖：医学检验、卫生检验(食品、药品安全检测)、新药临床试验(CRO)、健康体检。经过十五年的发展，金域检验员工人数逾3800 人，2011年营业额达7个亿，在广州、香港、南京、济南、西安、合肥、郑州、重庆、成都、长春、昆明、贵阳、杭州、天津、长沙、南宁、沈阳、和上海等19个城市建立了综合性检测中心，目前已经发展成为立足广州辐射全国的现代生物技术服务的集团企业。