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ELISA 技术的操作要点
ELISA试剂盒样品收集、处理及保存方法
1. 血清:使用不含热原和内毒素的试管,操作过程中避免任何细胞刺激,收集血液后,3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2. 血浆:EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。
3. 细胞上清液:3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。
4. 组织匀浆:将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。
5. 保存:如果样本收大鼠内毒素(ET)ELISA试剂盒集后不及时检测,请按一次用量分装,冻存于-20℃,避免反复冻融,在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
血清标本可按常规方法采集,应留意避免溶血,红细胞溶解时会开释出具有过氧化物酶活性的物质,以HRP 为标记的ELISA 测定中,溶血标本可能会增加非特异性显色。ELISA的操纵因固相载体的形成不同而有所差异,海内医学检修一般均用板式点。
标本的采取和保留
可用作ELISA测定的标本十分广泛,体液(如血清)、分泌物(唾液)和排泄物(如尿液、粪便)等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。反复冻融会使抗体效价跌落,所以测抗体的血清标本如需保留作多次检测,宜少量分装冰存。一般说来,在5天内测定的血清标本可放置大鼠内毒素(ET)ELISA试剂盒于4℃,超过一周测定的需低温冰存。如在冰箱中保留过久,其中的可发生聚合,在间接法ELISA 中可使本底加深。保留血清自采集时就应留意无菌操纵,也可加入适当防腐剂。除特殊情况外,在医学检修中均以血清作为检测标本。本文将叙述板式ELISA各个操纵步骤的留意要点,珠式、管式及磁性球ELISA,进口ELISA试剂盒均与特殊仪器配合应用,两者均有具体的使用说明,严格遵照划定操纵,必能得出正确的结果。
优质的试剂,良好的仪器和准确的操纵是保证ELISA试剂盒检测结果正确可靠的必要前提。血清标本宜在新鲜时检测。血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外,其他成份均同大鼠内毒素(ET)ELISA试剂盒即是血清。如有细菌污染,菌体中可能含有内源性HRP ,也会产生假阳性反应。有些标本可直接进行测定(如血清、尿液),有些则需经预处理(如粪便和某些分泌物)。制备血浆标本需借助于抗凝剂,而血清标本只要待血清天然凝固、血块收缩后即可取得。大部门ELISA检测均以血清为标本。在ELISA中血浆和血清可平等应用。冻结血清融解后,蛋白质局部浓缩,分布不均,应充分混匀宜轻缓,避免气泡,可上下倒置混和,不要在混匀器上强烈振荡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤,澄清后再检测。
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