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尽管ELISA测定的操作步骤非常简单,人N端外显肽(Ext-N)检测试剂盒但有可能会影响测定结果的因素却较多,分布在测定操作的各步之中,尤以加样、温育和洗板为甚。为帮助大家分析查找测定中出现问题的可能原因,特对常见问题及原因归纳总结于下表。
人N端外显肽(Ext-N)检测试剂盒问题可能的原因(非试剂盒本身的原因)
一.弱阳性质控样本检测不出
温育的时间或温度不够;显色反应时间太短;所用配制缓冲液的蒸馏水有问题
二.测定的重复性差(相同样本两次测定结果不一致)
这是典型的由测定操作引起的问题,包括:(1)加样本及试剂量不准;孔间不一致;(2)加样过快,孔间发生污染;(3)加错样本;(4)加样本及试剂时,加在孔壁上部非包被区;(5)不同批号试剂盒中组分混用;(6)人N端外显肽(Ext-N)检测试剂盒温育时间、洗板、显色时间不一致;(7)孔内污染杂物;(8)酶标仪滤光片不正确;(9)血清标本未完全凝固即加入,反应孔内出现纤维蛋白凝固或残留血细胞,易出现假阳性反应等。
三.白板(阳性对照不显色)
(1)漏加酶结合物;
(2)洗板液配制中出现问题,如量筒不干净,含酶抑制物(如叠氮钠)等。
(3)漏加显色剂A或B;
(4)终止剂当显色剂使用。
四.全部板孔均有显色
(1)洗板不干净;
(2)显色液变质;
(3)加底物的吸光受酶污染;
(4)洗板液受酶等污染。
使用微量加样器加样必须注意的关键点是:人N端外显肽(Ext-N)检测试剂盒加样不可太快,要避免加在孔壁上部,不可溅出和产生气泡。加样太快,无法保证微量加样的准确性和均一性。加在孔壁上部的非包被区,易导致非特异吸附。溅出会对邻近孔产生污染。出现气泡则反应液界面有差异。试剂的加入在国产试剂盒中基本上均是从滴瓶中滴加,除了要注意滴加的角度外,滴加的速度也很重要,滴加太快,很容易出现重复滴加或加在两孔之间的现象,这样就会在孔内的非包被区出现非特异吸附,从而引起非特异显色。所以,有时候一份标本用相同的试剂盒这次测定为阳性,下次测定为阴性,往往就是上述加样及试剂的错误所致.
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