产品详情
上海远慕生物新品供应美国Omega品牌旗下的质粒高纯(高性能)小量提取试剂盒,质粒小量提取试剂盒I型,质粒小量提取试剂盒II型,快速过滤超大量质粒提取试剂盒,超快速96孔质粒小量提取试剂盒,无内毒素小量质粒提取试剂盒 I/II,BAC/PAC大型质粒提取试剂盒,胶回收/PCR纯化试剂盒,RNA探针纯化试剂盒,磁珠寡核苷酸纯化试剂盒,循环DNA提取试剂盒,法医样品DNA提取试剂盒,其他系列等,本司为美国Omega品牌代理商,了解更多提取试剂盒资讯请来电洽谈!
名称:质粒高纯(高性能)小量提取试剂盒
品牌:Omega
供应商:上海远慕
货号/型号:D7043-01/HP Plasmid Mini Kit I(50)
货号/型号:D7043-02/HP Plasmid Mini Kit I(200)
货号/型号:D7045-01/HP Plasmid Mini Kit II(50)
货号/型号:D7045-02/HP Plasmid Mini Kit II(200)
用途:从富含核酸核酸的菌株中纯化高纯度的质粒DNA
质粒小量提取试剂盒特性与优点:
安全-无酚氯仿等危险的有机物抽提
可靠-操作简单,每次都能获得理想的效果
高纯-几乎不含蛋白质的污染,可长期保存
稳定-彻底去除核酸酶,质粒更稳定
质粒高纯(高性能)小量提取试剂盒操作步骤:
提示:第一次使用前请先在漂洗液WB和去蛋白液PE瓶中加入指定量无水乙醇,充分混匀,加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇,以免多次加入! e 将RNase A全部加入溶液P1中,混匀,每次使用后置于2-8℃保存。
1. 取1.5-4.5 ml过夜培养的菌液,12,000rpm离心30秒,尽可能的倒干上清,收集菌 体。 收集超过1.5 ml菌液, 可以离心弃上清后,在同一个1.5ml管内加入更多的菌液,重复步骤1,直到收集到足够的菌体。
2. 用250μl溶液P1重悬菌体沉淀,涡旋振荡至彻底悬浮。 如果有未彻底混匀的菌块,会影响裂解,导致提取量和纯度偏低。
3. 加250μl的溶液P2,温和地上下翻转6 -8次使菌体充分裂解,室温放置4分钟。 温和地混合,不要剧烈震荡,以免基因组DNA剪切断裂!所用时间不应超过5分钟!以免质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠,如果菌体少,很快清亮粘稠后就可以做下一步,不是一定要准确的5分钟。
4. 加350μl溶液P3,立即温和地上下翻转6 -8次,充分混匀时会出现白色絮状沉淀。 13,000rpm离心10分钟,小心取上清。
加入溶液P3后应该立即混匀,以免产生SDS的局部沉淀。 平衡液预处理吸附柱: 使用平衡液预处理硅胶膜吸附柱为必做步骤,具体方法参见前文“关于平衡液的使用”
5. 将上一步所得上清加入吸附柱AC中(吸附柱放入收集管中), 12,000rpm离心 30-60秒,倒掉收集管中的废液。
6. 可选步骤:加入500μl去蛋白液PE,12,000rpm 离心30-60秒,弃废液。 此步骤为了去除痕量核酸酶等杂质,如所用菌株为JM系列、HB101等endA菌株或野生型菌株,核酸酶含量丰富,应加此步骤;如所用菌株为XL-1 Blue、Top10和DH5α等缺陷型菌株,核酸酶含量低,则可略过此步骤。
7. 加入600μl漂洗液WB(请先检查是否已加入无水乙醇!),12,000rpm 离心30秒, 弃掉废液。
8. 加入600μl漂洗液WB,12,000rpm 离心30秒,弃掉废液。
9. 将吸附柱AC放回空收集管中,13,000rpm离心2分钟,尽量除去漂洗液, 以免 漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
10. 取出吸附柱AC,放入一个干净的离心管中,在吸附膜的中间部位加50-100μl洗 脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在 65-70℃水浴中加热效果更好),室温放置2分钟,12,000rpm 离心1分钟。如果需要较多量质粒,可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中,离心1分钟。 洗脱体积越大,洗脱效率越高。如果需要质粒浓度较高,可以适当减少洗脱体积, 但是最小体积不应少于30μl,体积过小降低质粒洗脱效率,减少质粒产量。
质粒高纯(高性能)小量提取试剂盒注意事项:
1.所有的离心步骤均在室温完成,使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机, 如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。
2.提取质粒的量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。一般高拷贝质粒,建议 接种单菌落于1.5-4.5 ml加合适抗生素的LB培养基, 过夜培养14-16个小时,可提取出多达20μg的纯净质粒。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒,应适当加大菌体使用量,使用5-10 ml过夜培养物,同时按比例增加P1、P2、P3的用量,其它步骤相同。
3.得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。OD260 值为1相当于大约50μg/ml DNA。电泳可能为单一条带,也可能为2条或者多条DNA条带,这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成,与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。本公司产品正常操作情况下基本超螺旋可以超过90%。
4.质粒DNA确切分子大小, 必须酶切线性化后,对比DNA分子量Marker才可以知 道。处于环状或者超螺旋状态的的质粒,泳动位置不确定,无法通过电泳知道其确切大小。
5.洗脱液EB不含有螯合剂EDTA,不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱,但应该确保pH大于7.5,pH过低影响洗脱效率。用水洗脱质粒应该保存在-20℃。质粒DNA如果需要长期保存,可以用TE缓冲液洗脱(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA,pH 8.0),但是EDTA可能影响下游酶切反应,使用时可以适当稀释。
说明:在某些大肠杆菌菌株内常常含有高活性的核酸酶,甚至多次接种的DH5α菌株(EndoA-)也会因发生突变而导致菌株的核酸酶复活。在常规的碱裂解法中,由于核酸酶不易失活而导致提取的质粒DNA发生降解,即使是纯化的质粒冷藏于-20°C,降解也常有发生。该系列试剂盒采用高活性的蛋白酶消化方法,能彻底去除菌株自身的核酸酶,从而保证纯化的质粒不会发生降解。因此,该系统适合于需要将纯化的质粒长期冷藏和频繁解冻使用的用户,适合于从含高活性核酸酶的菌株中纯化质粒DNA,适合于从动物身上刚分离出来的菌株中提取质粒。HP Plasmid Mini Kit I可以从1-5ml过夜培养菌液中提取出30ug 高纯质粒,HP Plasmid Mini Kit II可以从5-15ml过夜培养菌液中提取70ug 高纯质粒。
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