产品详情
DNA快速连接试剂盒
英文名称:Rapid DNA Ligation Kit
运输:低温
保存:负20度
有效期:1年
货期:1-2天
其他:
产品介绍:
产品及特点
DNA 连接反应通过 T4 连接酶催化双链 DNA 的 3'-OH 和 5'-P 形成磷
酸二脂键而将 DNA共价连接在一起。被连接的 DNA末端可以是粘末端(例
如限制性切割 EcoR I 产生的末端),也可以是平末端(限制性切割 Sma I
产生的末端)。Pheiffer 等人发现 PEG 可以促进 T4 DNA 连接酶催化的
连接反应[NAR, 11, 7853-7871, 1983],连接反应只需十分钟即可完成。
本产品就是根据这一原理设计,其特点如下:
1. 超快,整个连接反应只需要室温 5 分钟左右,反应液可以直接用于转
化实验。
2. 高效,溶液配方经过优化,每 ug 插入 DNA 连接转化得到的重组子可
达 107 左右。
3. 既可用于平末端连接,也可用于粘末端连接,包括 PCR 产物与 T 载
体的连接。
4. 简单,客户只需要提供载体和插入片段即可。
运输及保存 低温运输,-20℃保存,有效期一年。
使用方法 一: 连接反应
1. 在无菌的离心管中严格按下表顺序加入列各成分(以 10 uL 体系为
例):
成分 阴性对照管 样品管
溶液 A 5 uL 5 uL
插入片段(自备) - 0.2-0.5 ug(注)
载体(自备) 50 ng 50 ng
无菌水 补水到 9 uL 补水到 9 uL
注: 插入 DNA 片段的摩尔数最好是载体的 3-10 倍,如果载体长度
为 3000bp,则所需插入 DNA 片段折合成重量(ng) = (插入 DNA
片段 bp 数×50 ng×N)÷3000 bp。N 就是自己选定的插入 DNA
片段与载体的摩尔比。
2. 最后在每管中加入 1 uL 溶液 B,轻柔吹打混合均匀后用微量离心机
将液体全部甩到管底。
3. 室温放置至少 5 分钟,最长可以放置过夜。
4. 70℃保温 10 分钟。此步可以灭活有关的酶,否则转化效率有所降低。
5. 根据使用的转化方法,每管各取适量用于转化实验,余下的放置在
-20℃保存。
二:细菌转化及筛选(仅供参考,本产品不提供相关试剂)
6. 将 100 μL 转化效率在 1×108 cfu/μg 以上的感受态细胞于冰上解
冻。
7. 取 5-10 μL 连接产物加入到感受态细胞中,轻轻旋转几次以混匀。
8. 在冰上放置 30 分钟。
9. 将离心管放 42℃热休克 90 秒,然后快速将其转移到冰浴中放置 1~2
分钟。
10. 每管中加 900 μL LB 培养基,37℃振荡培养 1 小时复苏细胞。
11. 将 100 uL 复苏涂布到含 Amp 的 LB 琼脂平板上(根据载体情况也
可能需要加上 X-gal 和 IPTG)。
12. 室温 4,000 rpm 离心剩余的 900 uL 复苏细胞 5 分钟,弃去 800 μ
L 上清,用剩余 100 μL 培养基重悬细胞并涂布到含 Amp 的 LB 琼脂
平板上(可加 X-gal、IPTG)。
13. 将平板置于室温直至液体被吸收。此步非常重要,否则培养板将在
37℃排除水分,细菌将随水在培养基上到处游动,不能形成单个菌落。
14. 倒置平皿,于 37℃培养,12~16 小时后可出现菌落。一般情况下阳
性对照组会有上千个菌落(100 uL 转化液产生的菌落数×10),自 联
对照只有少数几个菌落,样品组的菌落数取决于 PCR 回收片段的质
量。
15. 按常规方法筛选重组子。