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pBR322大肠克隆质粒
基本信息
复制子: PBR322 ori
质粒分类: 大肠系列质粒;大肠克隆质粒;基因克隆质粒
质粒大小: 4361bp
原核抗性: 氨苄青霉素Amp(100μg/ml),四环素Tet(10μg/ml)
克隆菌株: DH5α等大肠杆菌
培养条件: 37℃,有氧,LB
5'测序引物: PBR322.F(AAGTGCCACCTGACGTCTAA)
3'测序引物: PBR322.R (GCCTGCCACCATACCCAC )
备注: 应用很广的基因克隆质粒
质粒简介
pBR322质粒相对分子质量较小,它带有一个复制起始位点,保证了该质粒只在大肠杆菌的细胞中行使复制的功能。具有两种抗生素抗性基因——氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因,可供转化子的选择标记。具有较高的拷贝数,经过氯霉素扩增以后,每个细胞中可累积1000-3000份拷贝,该特性为重组体DNA的制备提供了极大的方便。同时,由于其为人工构建质粒,虽然带有抗药性基因,但已不能在自然界的宿主细胞间转移,同时应用安全菌株,亦不会引起抗生素抗性基因传播。
pBR322是一个人工构建的重要质粒,有万能质粒之称。它是由pSF2124、pMB1及pSC101三个亲本质粒经复杂的重组过程构建而成的。质粒载体pBR322是研究得最多,使用最早且应用最广泛的大肠杆菌质粒载体之一。符号质粒载体pBR322中的“p代表质粒;“BR”代表两位两位研究者Bolivar和Rogigerus姓氏的字首,“322”是实验编号。
质粒载体pBR322的大小为4361bp,相对分子质量较小的是它第一个优点。优点之二是它带有一个复制起始位点,保证了该质粒只在大肠杆菌的细胞中行使复制的功能。具有两种抗生素抗性基因——氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因,可供转化子的选择标记是它的第三个优点。
质粒图谱
pBR322大肠克隆质粒使用说明:
1、收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min,再加入20μl无菌水溶解质粒,室温放置1min;
2、从-80℃冰箱中取出相应的感受态,置于冰盒上解冻,并做好标记;
3、取2μl质粒加至100μl感受态中,冰浴30min;
4、42℃热激90s,再冰浴2min;
5、加入900μl无抗的LB液体培养基,180rpm震荡培养45min;
6、6000rpm离心5min,仅留100ul上清混匀菌体沉淀;
7、混匀后的菌液加至对应抗性的LB平板上,倒入适量玻璃珠,涂匀液体;
8、将平板正向培养1h,再倒置培养12h~16h;
9、挑取单克隆菌落至对应抗性的LB液体培养基中,震荡培养12h~16h,根据实验需要提取质粒。
pBR322大肠克隆质粒注意事项:
1、如果您收到的是甘油菌种,请先四区划线,挑取单克隆培养。
2、如果第二天转化平板长的过多,请将质粒按比例稀释后再转化。
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