pTrcHisA大肠表达质粒

基本信息

启动子: Trc/lac

复制子: PBR322 ori

终止子: rrnB T2

质粒分类: 大肠杆菌载体；pTrc系列表达质粒

质粒大小: 4414bp

质粒标签: N-His，N-EK，N-Xpress

原核抗性: 氨苄青霉素Amp

克隆菌株: 大肠杆菌DH5α

培养条件: 37℃，有氧，LB

表达宿主: 大肠杆菌

培养条件: 37℃，有氧，LB

诱导方式: IPTG或乳糖及其类似物

5'测序引物: pTrcHis-F: GAGGTATATATTAATGTATCG

3'测序引物: pTrcHis-R:GATTTAATCTGTATCAGG

备注: pTrc表达质粒

质粒简介

        pTrcHis载体是来由pBR322质粒衍生而来的表达载体,设计用来在大肠杆菌中进行重组蛋白的高效表达和纯化。载体上的Trc启动子和rrnB抗终止区使得高水平蛋白表达成为可能.Trc启动子由Trp启动子的-35区域和Lac启动子的-10区域共同组成。pTrcHis载体同时包含有一个LacIq基因，该基因编码了Lac启动子的抑制蛋白。LacIq基因的存在使得宿主菌是LacIq+还是LacIq-都可以高效抑制插入基因的转录。进行蛋白表达时，大肠杆菌需要生长到对数生长期，然后加入1mM IPTG，去除阻遏蛋白，诱导表达。载体上pTrcHis载体是来由pBR322质粒衍生而来的表达载体,设计用来在大肠杆菌中进行重组蛋白的高效表达和纯化。载体上的Trc启动子和rrnB抗终止区使得高水平蛋白表达成为可能.Trc启动子由Trp启动子的-35区域和Lac启动子的-10区域共同组成。pTrcHis载体同时包含有一个LacIq基因，该基因编码了Lac启动子的抑制蛋白。LacIq基因的存在使得宿主菌是LacIq+还是LacIq-都可以高效抑制插入基因的转录。进行蛋白表达时，大肠杆菌需要生长到对数生长期，然后加入1mM IPTG，去除阻遏蛋白，诱导表达。载体上的迷你顺反子结构能够增强插入基因的转录水平，从而高水平表达目的蛋白。DNA插入片段位于载体表达片段下游，在其上游有一个N-端融合表达多肽序列，该序列包含有ATG起始密码子，6xHis标签，T7噬菌体10号基因的翻译增强子，X press抗原表位，肠激酶酶切识别位点的迷你顺反子结构，能够增强插入基因的转录水平，从而高水平表达目的蛋白。DNA插入片段位于载体表达片段下游，在其上游有一个N-端融合表达多肽序列，该序列包含有ATG起始密码子，6xHis标签，T7噬菌体10号基因的翻译增强子，X press抗原表位，肠激酶酶切识别位点。

质粒图谱

pTrcHisA大肠表达质粒使用说明：

     1、收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min，再加入20μl无菌水溶解质粒，室温放置1min；

     2、从-80℃冰箱中取出相应的感受态，置于冰盒上解冻，并做好标记；

     3、取2μl质粒加至100μl感受态中，冰浴30min；

     4、42℃热激90s，再冰浴2min；

     5、加入900μl无抗的LB液体培养基，180rpm震荡培养45min；

     6、6000rpm离心5min，仅留100ul上清混匀菌体沉淀；

     7、混匀后的菌液加至对应抗性的LB平板上，倒入适量玻璃珠，涂匀液体；

     8、将平板正向培养1h，再倒置培养12h~16h；

     9、挑取单克隆菌落至对应抗性的LB液体培养基中，震荡培养12h~16h，根据实验需要提取质粒。

pTrcHisA大肠表达质粒注意事项：

      1、如果您收到的是甘油菌种，请先四区划线，挑取单克隆培养。

      2、如果第二天转化平板长的过多，请将质粒按比例稀释后再转化。